提高金霉素产量的方法及其重组表达载体和基因工程菌技术

本发明专利技术公开了提高金霉素产量的方法及其重组表达载体和基因工程菌，通过利用FADH2依赖型氯化酶基因ctcP和FAD还原酶基因ctcQ构建重组表达载体，将重组表达载体转化至金色链霉菌（Streptomycesaureofaciens）中获得高产金霉素的基因工程菌株，获得的工程菌株通过超量表达FADH2依赖型氯化酶基因ctcP和FAD还原酶基因ctcQ打破金霉素合成途径中氯代反应的瓶颈，从而提高金色链霉菌中金霉素的产量；该菌株的获得为提高金霉素产量、降低金霉素生产成本奠定了基础。

To improve the method of chlortetracycline yield and its recombinant expression vector and gene engineering bacteria

The invention discloses a method for improving the yield of the recombinant expression vector and chlortetracycline and gene engineering bacteria by using FADH2 chloride dependent enzyme gene ctcP and FAD reductase gene ctcQ recombinant expression vector, the recombinant expression vector into Streptomyces aureofaciens (Streptomycesaureofaciens) gene engineering strains with high yield of chlortetracycline obtained, the expression of bottleneck of FADH2 Engineering strain chloride dependent enzyme gene ctcP and FAD reductase gene ctcQ break the chlorinated reaction via chlortetracycline biosynthesis of excess, so as to improve the yield of chlortetracycline s.aureofaciens; the strain lays a foundation for improving the yield and reduce the production cost of chlortetracycline chlortetracycline.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及通过FADH2依赖型氯化酶基因和FAD还原酶基因联合应用提高金霉素产量的方法，还涉及含FADH2依赖型氯化酶基因和FAD还原酶基因的重组载体和基因工程菌。
技术介绍
自上个世纪70年代，随着分子克隆技术的出现，以及对细胞生物学的深入研究，使基因工程技术成为遗传改造的常规手段。基因工程技术的应用在一定范围内克服了传统育种技术的随机性和盲目性，在改良工业菌种方面获得了巨大的成功。例如:在井R霉素生物合成过程中，通过强启动子超量表达m)P-葡萄糖焦磷酸酶的方式增加糖基供体UDP-葡萄糖的供给，能够有效的提高井R霉素的产量，并且能够显著地减少前体有效氧胺的大量积累(Zhou X et al Over-expression of UDP-glucose pyrophosphorylase increasesvalidamycin A but decreases validoxylamine A production in Streptomyceshygroscopicus var.jinggangensis 5008.MetabolicEngineering,2011,13 (6):768-76)。金霉素(Chlortetracycline,aureomycin,氯四环素)作为第一个发现的四环素类抗生素，产生菌株为金色链霉菌(Streptomyces aureofaciens),但是金色链霉菌在发酵过程中不仅产生金霉素，还能够产生一定比例的四环素(约8%)。为了提高金霉素产量，通过遗传育种和优化发酵条件的方法，但是通过遗传育种获得的提高金霉素产量的能力有限。而金霉素与四环素的区别是前者比后者在C7位多一个氯原子，金霉素生物合成过程中，基因簇中的FADH2依赖的氯化酶催化完成氯代反应(图1)。因此，氯代反应是否为金霉素生物合成的瓶颈步骤，是利用基因工程手段提高金霉素产量亟待解决的技术问题，为进一步提高金霉素的产量具有重要意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种FADH2依赖型氯化酶基因和FAD还原酶基因的联合应用，打破金霉素合成途径中的限速步骤，获得高产金霉素的基因工程菌株。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案: FADH2依赖型氯化酶基因ctcP和FAD还原酶基因ctcQ在金色链霉菌(泣aureofaciens)中提高金霉素产量的应用,所述FADH2依赖型氯化酶基因ctcP的核酸序列如SEQ ID N0.3中第11-1687位所示，所述FAD还原酶基因CiM的核酸序列如SEQ ID N0.6中第11-586位所示。本专利技术的可以应用于含金霉素合成途径的任意菌株中，优选为金色链霉菌(S trep tomyces aureofacien s^ F3,保藏号为 CCTCC NO: M 2013080。金色链霉菌{Streptomyces aureofaciens)F3为金河生物科技股份有限公司经过长期驯化和不断筛选获得适于工业生产的菌株，与常规的金色链霉菌菌株相比活性更高，产金霉素能力更强。本专利技术的目的之二在于提供含FADH2依赖型氯化酶基因ctcP和FAD还原酶基因ctcQ的基因工程菌，提供高产金霉素的菌株。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案: 含有所述FADH2依赖型氯化酶基因CiM和FAD还原酶基因ctcQ的基因工程菌。优选的,所述工程菌为金色链霉菌mreofaciens')。更优选的,所述工程菌为金色链霉菌保藏号为CCTCC NO: M 2013080。本专利技术的目的之三在于提供含FADH2依赖型氯化酶基因ctcP和FAD还原酶基因CicP的重组表达载体，技术方案为: 含有所述FADH2依赖型氯化酶基因CiM和FAD还原酶基因ctcQ的重组表达载体。本专利技术的目的之四载体提供重组表达载体的制备方法，技术方案为: 所述重组表达载体的制备方法，由以下步骤制备: a.用带酶切位点的引物克隆FADH2依赖型氯化 酶基因cic八然后连接至pIB139载体强启动子/下游，得到质粒PJTU4303 ； b.用带酶切位点的引物克隆FAD还原酶基因cic认然后连接至pIB139载体强启动子Pernm下游，得质粒PJTU4304， c.将步骤b所得质粒PJTU4304进行酶切，切下含强启动子和FAD还原酶基因ctcQ的片段，然后连入线性化的质粒PJTU4303中，得到含FADH2依赖型氯化酶基因ctcP和FAD还原酶基因ctcQ的重组载体。优选的，所述步骤a中，所述带酶切位点的引物如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所/Jn ο优选的，所述步骤b中，所述带酶切位点的引物如SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5所/Jn ο优选的，所述步骤c是重组质粒PJTU4304用HindIII酶切，回收含强启动子PermE*和FAD还原酶基因ctcQ片段并将回收片段用Klenow I酶补平；同时用EcoRV线形化PJTU4303质粒，将补平的含强启动子和FAD还原酶基因ctcQ片段连接入线性化的pJTU4303质粒中，得重组表达载体。本专利技术的有益效果在于:本专利技术通过联合应用FADH2依赖型氯化酶基因CiM和FAD还原酶基因ctcQ,过表达FADH2依赖型氯化酶和FAD还原酶，打破金霉素合成途径中的瓶颈步骤，将FADH2依赖型氯化酶基因CiM和FAD还原酶基因海建重组表达载体，然后转化入金色链霉菌中，提高金霉素的产量，与原始菌株相比金霉素产量提高了 18.89%，并且提高了金霉素组分的比例(金霉素/四环素提高了 1-2%);利用本专利技术的方法构建高产金霉素的菌株，制备方法简单，突破了遗传育种的瓶颈，为提高金霉素产量提供了新的思路。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明: 图1为金霉素和四环素的化学结构。图2为PJTU4303质粒和pJTU4304质粒构建构流程图。图3为整合型质粒PJTU4305构建流程图。图4为金色链霉菌PCR检测；F3泳道为工业菌株阴性对照，pIB泳道为空质粒PIB139空质粒对照；泳道1-12为基因工程菌。图5为金色链霉菌F3及金色链霉菌ZT03发酵产物HPLC检测结果(A:发酵液的提取液色谱检测图:金色链霉菌F3与金色链霉菌ZT03中金霉素含量检测结果)。菌种保藏 本专利技术中金色链霉菌iStreptomyces aureofaci ens )F3是金河生物科技股份有限公司从金色链霉菌中经过长期驯化和不断筛选获得的适于工业生产的菌株，该菌株与常规金色链霉菌相比活性更高，产金霉素能力更强，金霉素产量达20g/L。将分离获得的金色链霉菌{Streptomyces送中国典型培养物保藏中心保藏,保藏编号为CCTCC NO:M 2013080，地址位于中国武汉武汉大学，保藏日期为2013年3月13日，分类命名为金色链霉菌(S trep tomyces aureofaci ens ) F3。具体实施例方式下面将结合附图，对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。实施例1 构建含FADH2依赖型氯化酶基因ctcP和FAD还原酶基因ctcQ的重组表达质粒，具体为整合型质粒。根据FADH2依赖的氯化酶基因ctc本文档来自技高网...

【技术保护点】
FADH2依赖型氯化酶基因ctcP和FAD还原酶基因ctcQ在金色链霉菌（Streptomyces?aureofaciens）中提高金霉素产量的应用，所述FADH2依赖型氯化酶基因ctcP的核酸序列如SEQ?ID?NO.3中第11?1687位所示，所述FAD还原酶基因ctcQ的核酸序列如SEQ?ID?NO.6中第11?586位所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：谢昌贤，由德林，朱涛，刘运添，王鹏飞，李兰枝，邓子新，
申请(专利权)人：金河生物科技股份有限公司，上海交通大学，
类型：发明
国别省市：