本文描述了使用异碱基扩增引物(Iso-base?Amplification?Primer，“IAP”)来增加扩增反应的退火特异性的方法。IAP包含异区域(iso-region)，其能调节序列特异性退火，从而增强核苷酸序列特异性扩增的引物-模板杂交。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术技术一般性涉及分子生物学、重组DNA技术和核酸扩增领域。更特别地，本专利技术技术涉及使用非标准碱基来增加扩增反应的特异性。背景核酸扩增是与分子生物学有关的重要方法。核酸扩增的多种方法需要在该方法的一些阶段中使寡核苷酸引物与模板核酸退火。扩增过程可导致靶核酸的指数増加。但是，靶核酸的成功扩增依赖于引物与其靶标(即其互补序列)退火的特异性。引物与非特异性位点退火还是特异地与其互补序列退火取决于多种因素，包括退火温度、引物长度、G/C含量、PH和可形成的ニ级或三级结构。鉴于与引物退火特异性有关的过多的变量，准确地预计在某些条件下哪个引物会与靶核酸特异地退火可以是困难的。概述在ー个方面，本公开内容提供了用于提高扩增反应的退火特异性的方法，包括在扩增条件下将核酸样品与至少ー种包含以下的引物相接触(a)与靶序列互补的3’区段；(b)处于所述3’区段之5’端的异区域(iso-region)，其中所述异区域包含至少两个连续或不连续的非标准碱基，其中所述异区域将所述至少ー种引物的退火座位限制到3’区段，以及其中所述至少两个连续或不连续的非标准碱基独立地选自异C(iso-C)和异G(iso-G)；(c)处于异区域之5’端的5’区段，其中所述5’区段包含与模板序列互补的核苷酸序列，其中与只具有3’区段的引物相比所述至少一种引物对模板序列有提高的退火特异性。在一个实施方案中，所述至少ー种引物长6至60个核苷酸。在一个实施方案中，所述异区域包含约I至约15个非标准碱基。在一个实施方案中，扩增反应选自PCR ;逆转录酶PCR ;实时PCR ;差异显示PCR ;基于PCR的基因组分析；随机引物PCR ;多重PCR ；长片段 PCR(long-range PCR)；线性 PCR ;反式 PCR ;定量 PCR ；降落 PCR(touchdown PCR)；原位PCR ;小载体PCR(vect0rette PCR);热不对称交错PCR ；以混合的寡核苷酸为引物的cDNA 扩增(mixed oligonucleotide-primed amplification of cDNA) ；cDNA 3，端的快速扩增(3' -Rapid Amplification of cDNA Ends) ；cDNA 5，端的快速扩增(5' -RapidAmplification of cDNA Ends);高分辨率熔解分析和引物延伸反应。在一个实施方案中，在与只具有3’区段的引物相比足以提高所述至少ー种引物的退火特异性的温度下进行退火步骤。 在另一方面，本公开内容提供了在两阶段反应中扩增靶核酸的方法，其包括(a)在第一退火温度进行模板序列的第一阶段扩增以形成第一扩增产物，所述扩增包含至少2轮以下循环使模板序列变性，使至少ー种引物退火以及使所述至少一种引物延伸，其中所述至少一种引物包含(i)与模板序列互补的3’区段；(ii)位于所述3’区段的5’端的异区域，其中所述异区域包含至少两个连续或不连续的非标准碱基，其中所述异区域将所述至少一种引物的退火座位限制到3’区段，以及其中所述至少两个连续或不连续的非标准碱基独立地选自异C和异G ; (iii)位于异区域5’端的5’区段，其中所述5’区段包含与模板序列互补的核苷酸序列；以及(b)在第二退火温度下进行第一扩增产物的第二阶段扩增，其包含至少一轮以下循环(i)使步骤(a)所产生的扩增产物变性，使至少一种引物退火和至少一种引物延伸；或者(ii)使步骤(a)产生的扩增产物变性，使包含与所述至少一种引物5’区段对应之序列的引物退火和延伸。在一个实施方案中，靶核酸是通过以下形成的cDNA : (a)使寡核苷酸dT引物或锚定的寡核苷酸dT引物与靶mRNA的多聚A尾区杂交，或使随机的六聚、七聚 和/或八聚寡核苷酸与靶mRNA杂交，和(b)逆转录靶mRNA以生成cDNA。在一个实施方案中，将所述两阶段扩增法应用于包括以下的组的方法中PCR ;多重DNA扩增；鉴定差异表达的基因；cDNA 3’端的快速扩增；cDNA 5’端的快速扩增；引物延伸反应；扩增全长cDNA ;扩增5’富集的cDNA ;DNA指纹分析(DNA fingerprinting) ;RNA指纹分析(RNA fingerprinting);鉴定多基因家族的保守同源区段；鉴定核苷酸序列变异；pre-miRNA扩增；rRNA扩增；PCR后的高分辨率熔解分析和诱变(mutagenesis)。在一个方面，本公开内容提供了提高至少一种引物的退火特异性的方法，其包括以下步骤(a)合成所述至少一种引物，其中3’区段与模板序列互补；(b)在所述3’区段的5’端并入包含至少两个连续或不连续非标准碱基的异区域，其中所述异区域将所述至少一种引物的退火座位限制到3’区段，由此与只具有3’区段的引物相比提高3’区段的退火特异性，以及其中所述至少两个连续或不连续的非标准碱基独立地选自异C和异G ; (c)在所述异区域的5’端并入5’区段，其包含与含有模板序列之模板的任何区域互补的核苷酸序列，由此与只具有3’区段的引物相比所述至少一种引物对模板序列具有提高的退火特异性。在一个实施方案中，所述合成包括选自以下的方法固相合成；DNA复制；逆转录；限制性消化；失控转录(run-off transcription) ；PCR ;基于PCR的方法；引物延伸；和连接。在一个实施方案中，所述至少一种弓I物序列长6至60个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。在一个实施方案中，所述异区域包含约I至约15个非标准碱基。在一个实施方案中，所述至少一种引物用于扩增反应或两阶段扩增反应中。附图简述图I是所述方法的一个示例性实施方案，其中第一张图显示初始的杂交，5’和3’端均杂交，其中异碱基区显示为鼓泡。下两张图是5’或3’区域与模板之间的错配的示例。最后，最后一张图显示IAP与之前复制的链杂交，其中异碱基彼此配对。该引物结合(priming)的Tm非常高，因而与任何初始的引物结合事件相比非常有利。详述应理解以下以多种详细程度描述了一些方面、方式、实施方案、变化和技术特征，以提供对本公开内容的基本理解。在本专利技术技术的实施中，使用多种分子生物学、蛋白质生物化学、细胞生物学、微生物学和重组DNA的常规技术。这些技术是公知的，并且分别在例如以下文献中进行了解释Current Protocols in Molecular Biology, I-III 卷，Ausubel 编(1997) ；Sambrook等，Molecular Cloning ALaboratory Manual,第二版· (Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, NY(1989)) ；DNA Cloning A Practical Approach,第 I 和II卷，Glover 编(1985) ；01igonucleotide Synthesis, Gait 编(1984) ；Nucleic AcidHybridization, Hames & Higgins 编(1985) !Transcription and Translation, Hames&Hi本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：斯科特·约翰逊，T·S·拉玛瑟伯拉曼尼，凯瑟琳·恩格尔布雷克特，
申请(专利权)人：卢米耐克斯公司，
类型：发明
国别省市：
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