具有改进的产品特异性的蔗糖变位酶制造技术

本发明专利技术提供用于从蔗糖生物技术制备异麦芽酮糖和含异麦芽酮糖的组合物的改进的工具，所述工具尤其是具有改进的产品特异性的蔗糖变位酶以及包含所述改进的蔗糖变位酶的微生物细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有改进的产品特异性的蔗糖变位酶说明书本专利技术涉及由蔗糖生物技术制备异麦芽酮糖和含异麦芽酮糖的组合物和为此提供改进的工具(Mittel)，尤其是具有改进的产品特异性的蔗糖变位酶以及包含所述改进的蔗糖变位酶的微生物细胞。众所周知，在生物技术工艺中可通过酶促异构化由蔗糖(甘蔗糖、甜菜糖)制备异麦芽酮糖(帕拉金糖)。异麦芽酮糖是一种生理学有价值的糖，其作为蔗糖替代物质在食品和相关产品中的重要性日益增长。异麦芽酮糖是非致龋的并且在与蔗糖能量含量基本相同 的情况下具有低的血糖指数。自2005年以来，异麦芽酮糖已被允许用于食品中。此外，异麦芽酮糖是用于制备糖醇异麦芽酮糖醇的原料，异麦芽酮糖醇是1，6-GPS (6-0- a -D-批喃葡萄糖基-D-山梨醇)和1，I-GPM (1-0- a -D-吡喃葡萄糖基-D-甘露醇)的消旋混合物及其修饰物，尤其是GPS或GPM富集的混合物。众所周知，由蔗糖生物技术制备异麦芽酮糖在使用显示细菌酶活性的蔗糖变位酶，E. C. 5. 4. 99. 11 (同义词蔗糖变位酶、蔗糖异构酶、异麦芽酮糖合成酶)的优选固定的细菌细胞或其碎片的条件下进行。已知具有蔗糖变位酶活性且可以用于生物技术工艺的微生物，尤其是红色精I元杆菌(Protaminobacter rubrum)、大黄欧文菌(Erwinia rhapontici)、嗜中酸假单胞菌(Pseudomonas mesoacidophila)、分散泛菌(Pantoea dispersa)和普利茅斯沙雷氏菌(Serratia plymuthica)。其内源性鹿糖变位酶以SmuA、Pall、SmtA、MutB、SIM等缩写而闻名。蔗糖变位酶由染色体基因编码。在已知的生物技术体系中，蔗糖被不完全酶促异构为异麦芽酮糖。确切地说，其生成其它的异构产物和副产物。一种重要的其它异构产物是海藻糖。在微生物红色精朊杆菌(Protaminobacter rubrum)中存在鹿糖变位酶SmuA,其产品特异性被如此设计,使得即使在最佳的培养条件下也仅使最高约85%的鹿糖异构化为异麦芽酮糖。所述鹿糖变位酶SmuA的产品特异性是值得改善的。但是，用生物技术方法的异麦芽酮糖工业化生产是基于红色精朊杆菌(P. rubrum)的鹿糖变位酶SmuA。所以，本专利技术的目的在于，提供一种改进的基于SmuA的蔗糖变位酶以及一种包含这种改进的蔗糖变位酶的微生物，所述微生物具有改进的产品特异性和异麦芽酮糖选择性，由此提高异构化产品中异麦芽酮糖的比例，这样也可以更有效地在其它已知的生物技术工艺中进行蔗糖向异麦芽酮糖的转化。这里，本专利技术的目的特别在于，提供一种改进的基于SmuA的蔗糖变位酶，其可以用于基本无改变的、已经确立的工业化生物技术工艺中，而不必高成本地调整已确立的工艺中的反应条件和工艺流程。应避免使用来自其它生物的蔗糖变位酶和调整为新的生物技术工艺。作为本专利技术的基础的技术问题通过提供一种新的聚氨基酸分子得以完全解决，对于蔗糖向异麦芽酮糖的转化，所述聚氨基酸分子具有改进的蔗糖变位酶活性，即对异麦芽酮糖较高的产品特异性。根据本专利技术，所述改进的蔗糖变位酶具有氨基酸序列，其优选直接来源于红色精朊杆菌(Protaminobacter rubrum)的鹿糖变位酶SmuA的野生型序列,其中分别相对于SEQ ID NO. I中的野生型序列的位置号，在至少一个下述氨基酸位置中具有一个或多个以下列举的氨基酸取代S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369L和A346Q以及两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或者所有十种的组合。这里，根据本专利技术，所述位置取决于活性中心的位置而定。所以，本专利技术提供如下解决办法改进的新型的蔗糖变位酶，其特征在于，其具有、仅具有或其包含修饰的氨基酸序列，其选自相对于以SEQ ID NO. I表示的序列具有一个或多个下列氨基酸取代的氨基酸序列S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369L和 A346Q。本专利技术也涉及其功能性的修饰，即聚氨基酸分子具有、仅具有或包含根据本专利技术对以SEQ ID NO. I表示的序列进行修饰的氨基酸序列的片段，从而聚氨基酸分子具有根据 本专利技术改善的新型蔗糖变位酶的功能。本领域技术人员可以容易地由这里给出的序列数据制造相应的功能性修饰并以熟悉的方式测试其作为蔗糖变位酶的功能。在本专利技术的第一个实施方式中，所述氨基酸取代在位置S303处；优选取代为氨基酸P。在本专利技术一个替代的或另外的实施方式中，所述氨基酸取代在位置D302处；优选取代为氨基酸Y。特别优选S303P与D302Y的取代组合。在本专利技术一个替代的或另外的实施方式中，所述氨基酸取代在位置K180处；优选取代为氨基酸P。在本专利技术一个替代的或另外的实施方式中，所述氨基酸取代在位置M199处；优选取代为氨基酸I (M199I)。在本专利技术一个替代的或另外的实施方式中，所述氨基酸取代在位置Q276处；优选取代为氨基酸A。在本专利技术一个替代的或另外的实施方式中，所述氨基酸取代在位置A198处；优选取代为氨基酸D。在本专利技术一个替代的或另外的实施方式中，所述氨基酸取代在位置Y219处；优选取代为氨基酸F。在本专利技术一个替代的或另外的实施方式中，所述氨基酸取代在位置V324处；优选取代为氨基酸T。在本专利技术一个替代的或另外的实施方式中，所述氨基酸取代在位置T369处；优选取代为氨基酸L。在本专利技术一个替代的或另外的实施方式中，所述氨基酸取代在位置A346处；优选取代为氨基酸Q。除下文中详细描述的优选的多种氨基酸取代的组合而外，可以是单独的或组合的下列另外氨基酸M199I 组合 V114I、Q122R、Q276A、N423E、L426I、L426F。还优选的是S303P 与选自由 D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369L和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合。一种优选的组合是S303P+D302Y。一种优选的组合是S303P+M199I。另一种优选的组合是S303P+Q276A。另一种优选的组合是S303P+A198D。另一种优选的组合是S303P+Y219F。另一种优选的组合是S303P+V324T。另一种优选的组合是S303P+T369L。另一种优选的组合是S303P+A346Q。S303P 与 D302Y 以及选自由 K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369L 和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。S303P 与 K180P 以及选自由 D302Y、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369L 和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。S303P 与 M199I 以及选自由 D302Y、K180P、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369L 和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。S303P 与 Q276A 以及选自由 D302Y、K180P、M199I、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.12.23 DE 102009060935.01.具有以下氨基酸序列的蔗糖变位酶，所述氨基酸序列选自由相对于SEQID NO: I所示的序列，具有一个或多个氨基酸取代的氨基酸序列组成的组，所述氨基酸取代选自S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369L 和 A346Q。2.根据前述权利要求的蔗糖变位酶，其具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列相对于SEQ ID NO: I所示的序列具有氨基酸取代S303P。3.根据前述权利要求之一的蔗糖变位酶，其具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列相对于SEQ ID NO: I所示的序列至少具有氨基酸取代D302Y。4.根据前述权利要求之一的蔗糖变位酶，其具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列相对于SEQ ID NO: I所示的序列至少具有氨基酸取代S303P和D302Y。5.根据前述权利要求之一的蔗糖变位酶，其具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列相对于SEQ ID NO: I所示的序列至少具有氨基酸取代K180P。6.根据前述权利要求之一的蔗糖变位酶，其具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列相对于SEQ ID NO: I所示的序列至少具有氨基酸取代M199I。7.根据前述权利要求之一的蔗糖变位酶，其具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列相对于SEQ ID NO: I所示的序列至少具有氨基酸取代Q276A。8.根据前述权利要求之一的蔗糖变位酶，其具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列相对于SEQ ID NO: I所示的序列至少具有氨基酸取代A198D。9.根据前述权利要求之一的蔗糖变位酶，其具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列相对于SEQ ID NO: I所示的序列至少具有氨基酸取代Y219F。10.根据前述权利要求之一的蔗糖变位酶，其具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列相对于SEQ ID NO: I所示的序列至少具有氨基酸取代V324T。11.根据前述权利要求之一的蔗糖变位酶，其具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列相对于SEQ ID NO: I所示的序列至少具有氨基酸取代T369L。12.根据前述权利要求之一的蔗糖变位酶，其具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列相对于SEQ ID NO: I所示...

【专利技术属性】
技术研发人员：沃尔夫冈·埃勒，于尔格·艾克斯，卡斯滕·哈姆斯，米夏埃尔·克林贝格，斯蒂芬·佩尔泽，沃尔夫冈·瓦赫，
申请(专利权)人：甜糖曼海姆奥克森富特股份公司，
类型：发明
国别省市：