用于检测同种异体的、或供者特异性的非HLA抗体的方法技术

本发明专利技术公开了用于检测同种异体的、或供者特异性的非HLA抗体的方法，通过对用于检测抗体的混合抗原原料中预先特异性地清除HLA类抗原的实验设计，检测移植物受者样本中所有已知或未知的同种异体的、或供者特异性的非HLA类抗原的相应抗体。本检测方法既解决了目前以细胞为基础的同种异体的、或供者特异性的抗体检测技术中，由于HLA类抗原和非HLA类抗原在靶细胞的共表达导致无法直接区分HLA和非HLA抗体的缺点；也解决了以纯化抗原为基础的抗体检测技术中，纯化的HLA抗原只能检出相应的HLA抗体、纯化的特定非HLA抗原只检测特定非HLA抗体的缺点。

A method for the detection of allogeneic or donor specific non HLA antibodies

【技术实现步骤摘要】
用于检测同种异体的、或供者特异性的非HLA抗体的方法
本专利技术属于抗体检测
，涉及用于检测同种异体的、或供者特异性的非HLA抗体的方法。
技术介绍
在器官、组织和非自体的干细胞移植中，移植物受者产生的针对潜在的同种异体供者移植物抗原的抗体被称为同种异体抗体(alloantibody，AlloAb)；而对于确定的移植供者和受者的组合而言，移植物受者产生的针对供者移植物抗原的同种异体抗体则被定义为供者特异性抗体(DonorSpecificAntibody，DSA)。DSA已被临床确认是导致抗体介导的排斥反应(Antibody-MediatedRejection，AMR)的主要原因，并作为确诊AMR的必检指标被写入了移植排斥反应国际诊断标准。人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen，HLA)是最早被发现的、具有人群多态性的移植排斥相关抗原，近年来，随着HLA分子克隆技术和蛋白生化技术在移植研究中的广泛应用，HLA特异性的抗体和AMR相关关系的研究是近20年来学术界的热点课题。在HLA-AMR的深入研究中，人们逐渐发现HLA抗体并不能解释所有的AMR的发生，有很多病理上符合AMR诊断的形态学变化的病例中并无法找到任何HLA的抗体的存在。反复被证实的这种临床现象提醒移植免疫学的研究者们在当今过度强调HLA抗体和AMR的关联性的氛围中，我们需要重新思考“非HLA抗体”在AMR中的作用。另外，根据国际上最大的器官移植数据库(美国UNOS)的移植人群数据分析所得结果显示，在所有HLA无错配，也就是供受者之间HLA类型完全一致的情况下进行的器官移植，仍然有很高比例的移植器官最终失去功能。尽管不能排除部分病人可能存在其他非免疫因素(如顽固性感染等)引起的器官失功，但这样的结果给非HLA类抗原引起的免疫排斥反应的存在提供了大数据库资料的支持(Lancet2005；365:1570–76；CurrentOpinioninImmunology2005,17:541–545)。基于以上事实，“如何发现非HLA的其他移植相关抗原、如何检测非HLA类抗原的抗体”在确诊移植病人排斥反应的病因和确定相应的治疗措施时就变得尤为重要。从理论上来说，如果我们要检测非HLA类抗体，我们需要知道除了HLA之外到底还有哪些非HLA抗原的存在，在这个前提下，我们可以通过表达、纯化所有这些非HLA类的抗原，然后通过免疫学的抗原抗体结合反应机理，检测移植病人体内针对不同非HLA类抗原的相应抗体。遗憾的是，在多年的移植免疫学的研究中非HLA类抗原的发现非常有限的，其中相对比较突出的一类抗原是MIC(majorhistocompatibilitycomplexclassIchain-relatedgene)基因所编码的蛋白抗原。然而，事实证明利用MIC蛋白抗原检测到的相应抗体还远不能解释所有非HLA抗体介导的排斥反应。那么，在目前无法完全确认所有非HLA抗原的实际情况下，我们难道就不能发现移植病人体内存在非HLA抗体吗？现有技术在检测非HLA抗体时，有两种途径：1.纯化已知的某特定的非HLA类的抗原，做成试剂盒(如MIC抗原试剂盒)用于检测特定的非HLA抗体；2.利用表达某特定的非HLA类抗原的细胞作为靶细胞，检测样本中某特定的非HLA抗体。前者的缺陷是只能检出单一已知的非HLA抗体，漏检其他非HLA抗体；而后者的缺陷是所有有核细胞都有HLA的表达，另外，这些靶细胞除了表达已知的非HLA类抗原外也极有可能表达未被确认的其他非HLA类抗原，检测结果无法排除HLA抗体或其他未知的非HLA抗体的干扰作用，因而无法确认阳性反应一定是来自于某非HLA抗体的作用。如需确认，需要补做HLA抗体的检测。如果HLA抗体检测呈阴性，那细胞学检测的阳性结果可以解释为由非HLA抗体引起的，但仍然不能完全归因于某已知的非HLA抗体；但假如HLA抗体检测呈阳性，细胞学的阳性检测结果无法确切归因是由HLA抗体、已知非HLA抗体、未知非HLA抗体、或三者共同作用的结果。而事实上，大量的临床研究发现在抗体介导的排斥反应的病例中有54-71％甚至更高比例的病人HLA抗体是阳性的(Transplantation.2009Aug27；88(4):568-74；HLA.2017Nov；90(5):267-275)，这给我们确定或鉴别到底是HLA或非HLA抗体引起的排斥反应带来了很大的干扰作用。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供了用于检测同种异体的、或供者特异性的非HLA抗体的方法，利用HLA特异性抗体或其Fab′或F(ab′)2片段，对来源于同种异体组织细胞或供者来源细胞的纯化的膜蛋白组分或全细胞裂解液或其组分中HLA抗原蛋白进行预清除(HLAnegativeselection)，利用HLA被清除的膜蛋白组分或细胞裂解液或其组分，根据抗原抗体结合反应的原理，建立了检测非HLA类抗原特异性的抗体(简称“非HLA抗体”)的新型检测方法。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：用于检测同种异体的、或供者特异性的非HLA抗体的方法，包括以下步骤：1)从用于检测的原材料中提取含有HLA类抗原和非HLA类抗原的组合抗原；2)采用HLA类抗原特异性的抗体或抗体组合，清除组合抗原中的HLA类抗原，得到非HLA类抗原；3)固定非HLA类抗原，通过抗原抗体结合反应，检测被检样本中的非HLA抗体。优选地，步骤1)中，用于检测的原材料的来源包括：移植物供者或潜在供者来源的器官、组织(包括上皮、结缔、肌肉、神经组织)、细胞或其组分(包括上述各类组织(即，上述“上皮、结缔、肌肉、神经组织”)的组成细胞或其细分类型组分，如外周血细胞、或其组分:白细胞、血小板、红细胞)，或所述细胞经体外分离、培养、扩增后的细胞。优选地，步骤1)中，含有HLA类抗原和非HLA类抗原的组合抗原包括细胞膜表面抗原，细胞裂解液或其组分中的抗原，所述细胞裂解液的组分包括膜组分、胞浆组分、细胞核组分。优选地，步骤2)中，HLA类抗原特异性的抗体或抗体组合包括：单克隆或多克隆的针对HLA-I类、或/和II类抗原特异性的完整抗体或其Fab′或F(ab′)2片段，和所有HLA类抗原具有全反应性的HLA抗体、抗体片段、或其组合。优选地，步骤2)还包括对HLA类抗原清除作用有效性的验证：取部分清除反应后的产物包被固定非HLA类抗原用介质(如流式微球，ELISA平板等)，通过清除HLA类抗原时所用抗体或其他HLA特异性抗体验证其是否被清除彻底，如发现HLA类抗原未完全清除干净，则重复清除过程，直至完全清除。优选地，步骤3)中，通过检测平台固定非HLA类抗原，所述检测平台包括：酶联免疫吸附实验(ELISA)、固相膜、蛋白芯片、流式微球、luminex液相芯片微球等。优选地，步骤3)中，所述被检样本包括被检对象的体液，组织灌洗液，组织或细胞表面的洗脱液等。优选地，步骤3)中，和被固定的非HLA类抗原结合的抗体可以是IgG、IgM或其他类型的抗体或本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测同种异体的、或供者特异性的非HLA抗体的方法，包括以下步骤：/n1)从用于检测的原材料中提取含有HLA类抗原和非HLA类抗原的组合抗原；/n2)采用HLA类抗原特异性的抗体或抗体组合，清除组合抗原中的HLA类抗原，得到非HLA类抗原；/n3)固定非HLA类抗原，通过抗原抗体结合反应，检测被检样本中的非HLA抗体。/n

【技术特征摘要】
1.用于检测同种异体的、或供者特异性的非HLA抗体的方法，包括以下步骤：
1)从用于检测的原材料中提取含有HLA类抗原和非HLA类抗原的组合抗原；
2)采用HLA类抗原特异性的抗体或抗体组合，清除组合抗原中的HLA类抗原，得到非HLA类抗原；
3)固定非HLA类抗原，通过抗原抗体结合反应，检测被检样本中的非HLA抗体。


2.根据权利要求1所述的用于检测同种异体的、或供者特异性的非HLA抗体的方法，其特征在于，步骤1)中，用于检测的原材料的来源包括：移植物供者或潜在供者来源的器官、组织、细胞或其组分，或所述细胞经体外分离、培养、扩增后的细胞。


3.根据权利要求2所述的用于检测同种异体的、或供者特异性的非HLA抗体的方法，其特征在于，所述组织包括上皮、结缔、肌肉、神经组织，所述细胞或其组分包括上述各类组织的组成细胞或其细分类型组分。


4.根据权利要求1所述的用于检测同种异体的、或供者特异性的非HLA抗体的方法，其特征在于，步骤1)中，含有HLA类抗原和非HLA类抗原的组合抗原包括细胞膜表面抗原，细胞裂解液或其组分中的抗原，所述细胞裂解液的组分包括膜组分、胞浆组分、细胞核组分。


5.根据权利要求1所述的用于检测同种异体的、或供者特异性的非HLA抗体的方法，其特征在于，步骤2)中，HLA类抗原特异性的抗体或抗体组合包括：单克隆或多克隆的针对HLA-I类、或/和II类抗原特异性的完整抗体或其Fab′或F(ab′)2片...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡俊超，
申请(专利权)人：苏州才博医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32