一种衰老细胞的检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术提供了一种衰老细胞的检测试剂盒及其检测方法，所述试剂盒包括CD45阳性细胞负向富集试剂、染色体核型检测试剂和p16抗体；本发明专利技术通过整合多步骤多方法所需试剂，以细胞免疫荧光染色和染色体原位杂交为原理，并创造性地加入CD45阳性细胞负向富集试剂，特异性高效检测衰老细胞，结果直观，数据准确，为衰老细胞的检测及其后续应用分析提供有力工具。

A detection kit for senescent cells and its detection method

【技术实现步骤摘要】
一种衰老细胞的检测试剂盒及其检测方法
本专利技术属于细胞生物学领域，涉及一种衰老细胞的检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
衰老是一切生物体所共有的现象。在多细胞生物中，衰老的标志为多种细胞和组织功能的持续下降。衰老的最突出的特征之一是功能的逐渐丧失或退化，这种功能的丧失或退化发生在包括分子、细胞、组织和个体各个水平。在具有可再生组织的生物体中，衰老的另一标志还在于增生水平的提高，其中最为严重的即是癌症的发生。与其他衰老相关的退行性疾病类似，癌症的发病率大约在个体的整个寿命期的中期开始明显增加。越来越多的证据表明，细胞衰老这一压力应答机制与多种衰老相关病症直接或间接相关联。近年的研究结果(BakerDJetal.2016Naturallyoccurringp16-positivecellsshortenhealthylifespan.Nature530，184–189)支持细胞衰老在年龄相关的肿瘤发生率提高中所起到的作用，实验结果显示在小鼠体内去除衰老细胞后肿瘤发生的水平显著降低。细胞衰老是指当细胞经受潜在的致瘤压力时，细胞产生的基本上不可逆的增殖停顿的状态(CampisiJ，d’AddadiFagagnaF.2007Cellularsenescence:whenbadthingshappentogoodcells.Nat.Rev.Mol.CellBiol.8:729–40)，衰老细胞的增殖停顿不可逆这一现象提示细胞的衰老应答形成的原因之一可能就是抑制肿瘤发生。细胞衰老的诱因主要包括端粒的缩短、基因组损伤、丝裂原与增殖相关信号、表观遗传损伤和肿瘤抑制基因的激活。目前已经确证细胞的衰老至少涉及两条主要的肿瘤抑制相关的通路：p53/p21通路和p16INK4a/pRB通路。两条通路在上游都有调控因子，在下游都有效应因子，也都具有分支通路，并且相互间还存在交叉调控(LevineAJ，OrenM.2009.Thefirst30yearsofp53:growingevermorecomplex.Nat.Rev.Cancer9:749–58；ChauBN，WangJY.2003.CoordinatedregulationoflifeanddeathbyRB.Nat.Rev.Cancer3:130–38)。p53与pRB是主要的转录调控因子，p21是p53通路的下游效应因子，而p16INK4a是pRB的上游正向调控因子。在高等的真核生物体内，肿瘤抑制蛋白pRB和p53在细胞衰老中起着关键的守门员的作用。p16INK4a是INK4基因家族的一个前体基因，编码CDK4和CDK6蛋白的抑制剂，其表达在多种人类的癌症中通过多种机制被关闭。因此细胞衰老与癌症的发生之间有密切的关系，鉴定衰老状态能够对个体的衰老状态和肿瘤发生风险的判断给出一定提示。衰老细胞的代谢通常仍然处于活跃状态，且如上所述细胞增殖陷入不可逆的停顿；其形态上通常较正常细胞更加扩大，通常体积上会翻倍，如果贴壁时会呈现出扁平状的形态。目前已知衰老细胞会表达一些特定的标记基因，包括SA-βgal、p16INK4a、γH2AX等。p16INK4a在绝大多数正常细胞核组织中表达水平非常低，一般难以检测到，但当通过多种刺激诱导细胞衰老时则能够检测到。p16INK4a的表达水平在多种脊椎动物的组织中随着年龄的增加也逐渐提高，是鉴定衰老细胞的一种重要标记(ResslerS，BartkovaJ，NiedereggerH，BartekJ，Scharffetter-KochanekK，Jansen-DürrP，WlaschekM.2006.p16isarobustinvivobiomarkerofcellularaginginhumanskin.AgingCell5:379–89)。在组织水平上，通过免疫组化的方法检测p16INK4a与其他标志物在组织样本的衰老细胞中的组合表达情况，能够获得与年龄大小趋势一致的结果(WaaijerME，ParishWE，StrongitharmBH，vanHeemstD，SlagboomPE，deCraenAJSedivyJM，WestendorpRG，GunnDA，MaierAB.2012.Thenumberofp16INK4apositivecellsinhumanskinreflectsbiologicalage.AgingCell11:722–25)，表明在组织水平p16INK4a能够结合其他标志基因一起较为准确地检测到衰老细胞，进而反映出个体的衰老和健康状态，为肿瘤的预警提供了一定的佐证。但通过免疫组化法只能检测组织样本，对于待检测个体而言难度非常大，难以作为一种市场化的常规检测手段进行推广。有文章(LiuY，SanoffHK，ChoH，BurdCE，TorriceC，IbrahimJG，ThomasNE，SharplessNE.2009Expressionofp16(INK4a)inperipheralbloodT-cellsisabiomarkerofhumanaging.AgingCell.8(4):439-48.)报道了一种检测人外周血T细胞p16INK4a表达水平的方法，该方法通过定量PCR方法检测外周血中T细胞的p16INK4aRNA水平，发现表达水平与样本的年龄趋势吻合较好。但T细胞是一类较为特殊的细胞，激活的T细胞均能够稳定表达p16INK4a，不能等同视为体内真正的衰老细胞，因此虽然其p16INK4a表达水平与年龄的趋势吻合程度较高，仍然不能有效地反映体内真实的细胞衰老的状态，难以为体内肿瘤发生的风险提供有效的预警。CN108531594A公开了一种多基因联合用于膀胱癌早期筛查的无创检测方法及其试剂盒，所述联合基因为APC、NID2、p16，通过设计特异性甲基化引物分别检测APC、NID2、p16三个靶基因片段甲基化的核酸序列，实现对膀胱癌的早期筛查和辅助诊断。但该专利技术需要检测多种基因，且用于检测膀胱癌，并不能检测衰老细胞。因此，目前仍然缺乏一种能够有效检测个体血液中的衰老细胞的方法，提供一种简洁高效的衰老细胞的检测方法，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
技术实现思路
针对现有技术的不足及实际的需求，本专利技术提供一种衰老细胞的检测试剂盒及其检测方法，所述试剂盒以细胞免疫荧光染色和染色体原位杂交为原理，整合多步骤多方法所需试剂，并创造性地加入CD45阳性细胞负向富集试剂，特异性高效检测衰老细胞，结果直观，数据准确，为衰老细胞的检测及其后续应用分析提供有力工具。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种衰老细胞的检测试剂盒，所述试剂盒包括CD45阳性细胞负向富集试剂、染色体核型检测试剂和p16抗体。优选地，所述CD45阳性细胞负向富集试剂为偶联CD45抗体的载体，优选为偶联CD45抗体的磁珠。优选地，所述p16抗体为偶联荧光基团的p16抗体，优选为偶联AlexaFluor488的p16抗体。优选地，所述染色体核型检测试剂为染色体核型检测核酸探针，优选为偶联荧光基团的染色体核本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种衰老细胞的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括CD45阳性细胞负向富集试剂、染色体核型检测试剂和p16抗体。/n

【技术特征摘要】
1.一种衰老细胞的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括CD45阳性细胞负向富集试剂、染色体核型检测试剂和p16抗体。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括CD45抗体、细胞固定液、抗体清洗液、样品稀释液、清洗液、CD16阳性细胞负向富集试剂、CD19阳性细胞负向富集试剂或CD235a阳性细胞负向富集试剂中的任意一种或至少两种的组合。


3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述CD45阳性细胞负向富集试剂为偶联CD45抗体的载体，优选为偶联CD45抗体的磁珠；
优选地，所述p16抗体为偶联荧光基团的p16抗体，优选为偶联AlexaFluor488的p16抗体；
优选地，所述染色体核型检测试剂为染色体核型检测核酸探针，优选为偶联荧光基团的染色体核型检测核酸探针，进一步优选为偶联SpectrumOrange的CEP8FISHDNA探针。


4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述清洗液包括选自溶于PBS的1％v/vFBS、溶于PBS的0.5％w/vBSA和CRC清洗液中的任一种；
优选地，所述细胞固定液包括选自4％多聚甲醛和/或70％乙醇；
优选地，所述样品稀释液包括选自溶于PBS的1％v/vFBS和/或溶于PBS的0.5％w/vBSA；
优选地，所述抗体清洗液为含有NP-40的2×SSC缓冲液；
优选地，所述含有NP-40的2xSSC缓冲液为含有0.1％v/vNP-40的2×SSC的缓冲液；
优选地，所述CD45抗体为偶联荧光基团的CD45抗体，优选为偶联AlexaFluor594的CD45抗体；
优选地，所述CD16阳性细胞负向富集试剂为偶联CD16抗体的载体，优选为偶联AlexaFluor488的CD16抗体的磁珠；
优选地，所述CD19阳性细胞负向富集试剂为偶联CD19抗体的载体，优选为偶联CD19抗体的磁珠；
优选地，所述CD235a阳性细胞负向富集试剂为偶联CD235a抗体的载体，优选为偶联CD235a的磁珠。


5.一种用于非诊断与治疗目的的检测衰老细胞的方法，采用如权利要求1-4中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将血液样品进行预处理，去除血细胞和白细胞；
(2)将步骤(1)预处理后的样品进行细胞表面抗原染色并固定；
(3)将步骤(2)细胞表面染色后的样品进行染色体荧光原位杂交；
(4)将步骤(3)杂交后的样品进行胞内抗原染色，检测细胞免疫荧光染色结果。


6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述血液样品为外周血；
优选地，步骤(1)所述去除血细胞的方法为密度梯度离心。


7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述去除白细胞的方法为：
向去除血细胞后的样品中加入权利要求1-4中任一项所述试剂盒中的CD45阳性细胞负向富集试...

【专利技术属性】
技术研发人员：金华君，秦文霞，黄晨，沈永超，钱其军，
申请(专利权)人：上海细胞治疗集团有限公司，上海细胞治疗研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31