一种猪嵴病毒的培养方法技术

本发明专利技术公开了一种猪嵴病毒的培养方法，用MDCK细胞成功地对猪嵴病毒进行分离培养，并进行了传代，成功获得了可以用于猪嵴病毒分离传代的细胞系，利用PCR方法证实了其传代培养分离病毒的效果，首次提出了一种能用于猪嵴病毒培养的细胞系，具有一定的创新性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医学
，具体涉及一种猪嵴病毒的培养方法。背景内容目前，通过国内外资料查询，尚未找到合适猪嵴病毒传代的细胞系，为了能够找到适合猪嵴病毒传代的细胞系，用于猪嵴病毒的增殖传代，为进一步进行猪嵴病毒疫苗的研制以及诊断防制方法的开发，提供有效的途径。本试验中用于转染的细胞系有：BHK，VERO，293T,HELA,PK-15,ST等，但这些细胞都不能实现其稳定传代。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术旨在提供一种猪嵴病毒的培养方法，应用MDCK细胞成功地对猪嵴病毒进行分离培养，并进行了传代，成功获得了可以用于猪嵴病毒分离传代的细胞系。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种猪嵴病毒的培养方法，包括如下步骤：S1复苏MDCK细胞后，连续传代若干次，待细胞状态良好；S2将带有猪嵴病毒的粪便样品稀释，离心，离心后的上清过滤到无菌离心管中，即为接种病毒液；S3将鹅脱养胆酸CDCA用无水乙醇稀释，-20℃保存备用；S4进行猪嵴病毒接种前1天，将步骤S1得到的MDCK细胞在细胞培养瓶中再次进行细胞传代，细胞数量以第二天接种时细胞铺满所述细胞培养瓶的底部达90％的为准；S5对步骤S4中最终得到的MDCK细胞利用步骤S2的接种病毒液进行接种病毒，接种时细胞呈单层铺满状态且长势良好：5.1)先弃去步骤细胞培养瓶中原有的培养液，用1×PBS洗细胞表面然后除尽残留的PBS，然后将用1×PBS洗细胞表面并除尽残留的PBS的细胞分为实验1组、实验2组和对照组；5.2)分别将1mL步骤S2所得的接种病毒液轻轻加入到实验1组和实验2组细胞表面，然后盖上瓶塞，轻轻将摇晃瓶子，让接种病毒液在细胞面上来回几次，使病毒在细胞上均匀吸附；在对照细胞中，加入1mL维持液；5.3)将实验1组和实验2组的细胞和对照组细胞一起放入37℃的CO2培养箱培养1h；其中每隔20min，轻轻摇晃细胞瓶，使病毒液或维持液能充分接触细胞；5.4)吸弃实验1组和实验2组的病毒液以及对照组的维持液，然后在实验1组加入8mL FBS浓度为2％的维持液和浓度为50μM的步骤S3制得的CDCA 80μL，实验2组中加入8mL FBS浓度为2％的维持液，对照组加入8mL FBS浓度为2％的维持液，然后实验1组、实验2组和对照组在37℃CO2培养箱继续培养；5.5)每天观察实验1组、实验2组的细胞病变情况，当90％的
细胞出现CPE时即可收集对应实验组的病毒液；5.6)对于实验1组和实验2组，步骤5.5)中收集得到病毒液分装保存在2mL离心管，在12 000g离心3min，以此除去细胞碎片，收集离心后的上清液，用于病毒的传代培养和病毒的检测；5.7)猪嵴病毒在MDCK细胞上连续传50代。需要说明的是，步骤S1中，复苏的MDCK细胞连续传代2～3次。需要说明的是，步骤S2中，所述粪便样品5倍稀释。需要说明的是，步骤S2中，离心的条件为4℃，12000g，时间为5min。需要说明的是，步骤S2中，用0.22μm滤器对上清进行过滤。需要说明的是，步骤S3中，CDCA稀释为50mM的储存浓度。需要说明的是，步骤5.5)中，采用反复冻融的方法收集病毒液：将细胞培养瓶放入-20℃冰箱，细胞培养液完全结冻后，在流水中使其完全融化，摇动细胞瓶，使细胞破裂释放出病毒颗粒，如此反复3次。本专利技术的有益效果在于：应用MDCK细胞成功地对猪嵴病毒进行分离培养，并进行了传代，成功获得了可以用于猪嵴病毒分离传代的细胞系。本专利技术首次提出了一种能用于猪嵴病毒培养的细胞系。附图说明图1为本专利技术的总体流程图；图2为MDCK接种嵴病毒后第三代36h细胞病变情况；图3为MDCK接种嵴病毒后第三代RT-PCR检测结果。具体实施方式以下将结合附图对本专利技术作进一步的描述，需要说明的是，本实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围并不限于本实施例。如图1所示，一种猪嵴病毒的培养方法，包括如下步骤：S1复苏MDCK细胞后，连续传代若干次，待细胞状态良好；S2将带有猪嵴病毒的粪便样品(粪便样品采集自5日龄仔猪的小肠)稀释，离心，离心后的上清过滤到无菌离心管中，即为接种病毒液；S3将鹅脱养胆酸CDCA用无水乙醇稀释，-20℃保存备用；S4进行猪嵴病毒接种前1天，将步骤S1得到的MDCK细胞在细胞培养瓶中再次进行细胞传代，细胞数量以第二天接种时细胞铺满所述细胞培养瓶的底部达90％的为准；S5对步骤S4中最终得到的MDCK细胞利用步骤S2的接种病毒液进行接种病毒，接种时细胞呈单层铺满状态且长势良好：5.1)先弃去步骤细胞培养瓶中原有的培养液，用1×PBS洗细胞表面然后除尽残留的PBS，然后将用1×PBS洗细胞表面并除尽残留的PBS的细胞分为实验1组、实验2组和对照组；5.2)分别将1mL步骤S2所得的接种病毒液轻轻加入到实验1组和实验2组细胞表面，然后盖上瓶塞，轻轻将摇晃瓶子，让接种病
毒液在细胞面上来回几次，使病毒在细胞上均匀吸附；在对照细胞中，加入1mL维持液；5.3)将实验1组和实验2组的细胞和对照组细胞一起放入37℃的CO2培养箱培养1h；其中每隔20min，轻轻摇晃细胞瓶，使病毒液或维持液能充分接触细胞；5.4)吸弃实验1组和实验2组的病毒液以及对照组的维持液，然后在实验1组加入8mL FBS浓度为2％的维持液和浓度为50μM的步骤S3制得的CDCA 80μL，实验2组中加入8mL FBS浓度为2％的维持液，对照组加入8mL FBS浓度为2％的维持液，然后实验1组、实验2组和对照组在37℃CO2培养箱继续培养；5.5)每天观察实验1组、实验2组的细胞病变情况，当90％的细胞出现CPE时即可收集对应实验组的病毒液；可以采用反复冻融的方法收集病毒液：将细胞培养瓶放入-20℃冰箱，细胞培养液完全结冻后，在流水中使其完全融化，摇动细胞瓶，使细胞破裂释放出病毒颗粒，如此反复3次。5.6)对于实验1组和实验2组，步骤5.5)中收集得到病毒液分装保存在2mL离心管，在12 000g离心3min，以此除去细胞碎片，收集离心后的上清液，用于病毒的传代培养和病毒的检测；5.7)猪嵴病毒在MDCK细胞上连续传50代。以下采用PCR的方法证实本专利技术获得的用于猪嵴病毒分离传代的细胞系具有传代培养分离病毒的效果。1、引物设计与合成 根据GenBank公布的swKoV CH441株基
因序列(登录号：KF539763)，设计猪嵴病毒的检测引物。引物序列：K2F:CGTTGGGCTGAGCGTGTA；K2R:AGGGAGCAGAAGAAATGAGGTT。2、根据MiniBEST Universal RNA Extraction Kit试剂盒说明书，提取CH441株猪嵴病毒的RNA，利用One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit试剂盒RT-PCR扩增K2基因。K2基因是本专利技术设计的用于猪嵴病毒检测的扩增片段，它是猪嵴病毒2C基因的一部分，对猪嵴病毒的检测具有较高的特异性和灵敏性。PCR反应体系50μL：2×One Step Buffer 25μL，Prime Script 2μL，RNA模板7μL，上、下游引物(25μmol/本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪嵴病毒的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：S1复苏MDCK细胞后，连续传代若干次，待细胞状态良好；S2将带有猪嵴病毒的粪便样品稀释，离心，离心后的上清过滤到无菌离心管中，即为接种病毒液；S3将鹅脱养胆酸CDCA用无水乙醇稀释，‑20℃保存备用；S4进行猪嵴病毒接种前1天，将步骤S1得到的MDCK细胞在细胞培养瓶中再次进行细胞传代，细胞数量以第二天接种时细胞铺满所述细胞培养瓶的底部达90％的为准；S5对步骤S4中最终得到的MDCK细胞利用步骤S2的接种病毒液进行接种病毒，接种时细胞呈单层铺满状态且长势良好：5.1)先弃去步骤细胞培养瓶中原有的培养液，用1×PBS洗细胞表面然后除尽残留的PBS，然后将用1×PBS洗细胞表面并除尽残留的PBS的细胞分为实验1组、实验2组和对照组；5.2)分别将1mL步骤S2所得的接种病毒液轻轻加入到实验1组和实验2组细胞表面，然后盖上瓶塞，轻轻将摇晃瓶子，让接种病毒液在细胞面上来回几次，使病毒在细胞上均匀吸附；在对照细胞中，加入1mL维持液；5.3)将实验1组和实验2组的细胞和对照组细胞一起放入37℃的CO2培养箱培养1h；其中每隔20min，轻轻摇晃细胞瓶，使病毒液或维持液能充分接触细胞；5.4)吸弃实验1组和实验2组的病毒液以及对照组的维持液，然后在实验1组加入8mL FBS浓度为2％的维持液和浓度为50μM的步骤S3制得的CDCA 80μL，实验2组中加入8mL FBS浓度为2％的维持液，对照组加入8mL FBS浓度为2％的维持液，然后实验1组、实验2组和对照组在37℃CO2培养箱继续培养；5.5)每天观察实验1组、实验2组的细胞病变情况，当90％的细胞出现CPE时即可收集对应实验组的病毒液；5.6)对于实验1组和实验2组，步骤5.5)中收集得到病毒液分装保存在2mL离心管，在12 000g离心3min，以此除去细胞碎片，收集离心后的上清液，用于病毒的传代培养和病毒的检测；5.7)猪嵴病毒在MDCK细胞上连续传50代。...

【技术特征摘要】
1.一种猪嵴病毒的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：S1复苏MDCK细胞后，连续传代若干次，待细胞状态良好；S2将带有猪嵴病毒的粪便样品稀释，离心，离心后的上清过滤到无菌离心管中，即为接种病毒液；S3将鹅脱养胆酸CDCA用无水乙醇稀释，-20℃保存备用；S4进行猪嵴病毒接种前1天，将步骤S1得到的MDCK细胞在细胞培养瓶中再次进行细胞传代，细胞数量以第二天接种时细胞铺满所述细胞培养瓶的底部达90％的为准；S5对步骤S4中最终得到的MDCK细胞利用步骤S2的接种病毒液进行接种病毒，接种时细胞呈单层铺满状态且长势良好：5.1)先弃去步骤细胞培养瓶中原有的培养液，用1×PBS洗细胞表面然后除尽残留的PBS，然后将用1×PBS洗细胞表面并除尽残留的PBS的细胞分为实验1组、实验2组和对照组；5.2)分别将1mL步骤S2所得的接种病毒液轻轻加入到实验1组和实验2组细胞表面，然后盖上瓶塞，轻轻将摇晃瓶子，让接种病毒液在细胞面上来回几次，使病毒在细胞上均匀吸附；在对照细胞中，加入1mL维持液；5.3)将实验1组和实验2组的细胞和对照组细胞一起放入37℃的CO2培养箱培养1h；其中每隔20min，轻轻摇晃细胞瓶，使病毒液或维持液能充分接触细胞；5.4)吸弃实验1组和实验2组的病毒液以及对照组的维持液，然后在实验1组加入8mL FBS浓度为2％的维持液和浓度为50μM的
\t步骤S3制得的CDCA 80μL，实验2组中...

【专利技术属性】
技术研发人员：兰喜，杨彬，祝俊鹏，王琛，刘永生，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62