本申请提供了一种多特异性抗体及其制备方法和用途。所述多特异性抗体包含：a)能特异性结合第一抗原的Fab片段，其中所述Fab片段由一条轻链以及一条重链的CH1和可变区组成；b)第一肽接头，所述第一肽接头的N端与所述重链融合；c)第二肽接头，所述第二肽接头的N端与所述轻链融合，其中所述第一肽接头和所述第二肽接头之间仅能形成一个二硫键，并且各自独立地选自以下：包含Seq ID NO.1‑2所示序列中的任一种的肽接头，其中X代表除Cys的任意氨基酸，或者缺失。所述抗体可以容易地通过重组表达产生并且能够同时靶向结合两个不同抗原或同一抗原的不同表位，或更多不同抗原的多个表位。
A multispecific antibody and its preparation and Application
【技术实现步骤摘要】
一种多特异性抗体及其制备方法和用途
本申请通常涉及抗体领域。更具体地，本申请涉及一种多特异性抗体及其制备方法和用途。专利技术背景众所周知，天然抗体分子大多是二价单特异性分子。然而过去半个世纪以来，得益于抗体工程化的进展，人工产生了多种双特异性和多特异性抗体的分子。其形式多种多样，包括例如单链Fv抗体(scFv，Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85:5879-5883(1988))、四价IgG-scFv融合体(Coloma和Morrison，Nat.Biotechnol.，15:159-163(1997))、双链抗体(diabody)(Holliger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:6444-6448(1993))、串联scFv分子(参见例如Bargou等，Science321，974-977(2008))、四价IgG-样双可变结构域抗体(“DVD-Ig”，Wu等，Nat.Biotechnol.，25:1290-1297(2007))、四价Fab串联免疫球蛋白(“FIT-Ig”)，(WO2015/103072，EpimabBiotheraupeutics)、二价大鼠/小鼠杂合双特异性IgG(Lindhofer等，J.Immunol.，155:219-225(1995))和双特异性Crossmab结合蛋白(参见例如WO2013/026831(RocheGlycartAG)；WO2014/167022(EngmabAG))。由于双特异性或多特异性的抗体能够结合两个或多个不同表位或抗原靶点，并且具备某些联合分子所缺少的新功能(参见，例如Sergey等，DrugDesDevelTher.12:195–208(2018)中的综述)，因此用于治疗各种肿瘤的双特异或多特异性的抗体受到越来越多的关注，特别是用于“T细胞重定向”的双特异性抗体。这类双特异性抗体可以同时靶向肿瘤细胞上的表面抗原和T细胞表面受体(TCR)复合物的激活组分，如CD3，从而导致靶向攻击肿瘤的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的激活。这类双特异性抗体的代表形式是“双特异性T细胞接合物”或“BiTE”抗体，例如，包含通过甘氨酸-丝氨酸(G4S)接头连接的两个scFv抗体，其中一个scFv提供肿瘤抗原(例如17-1A肿瘤抗原)的结合位点，而另一个scFv提供T细胞上CD3抗原的结合位点(Mack等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：7021-7025(1995))。抗CD3×抗CD19BiTE抗体Blinatumomab，已被美国食品和药物管理局(FDA)批准用于治疗罕见形式的B细胞急性淋巴母细胞性白血病(ALL)。用于T细胞重定位的其他双特异性抗体形式包括但不限于四价串联双链抗体("TandAb,"Kipriyanov等，J.Mol.Biol.，293:41–56(1999)；Arndt等，Blood，94:2562-2568(1999))和双亲和性重新靶向蛋白("DART"，Johnson等，J.Mol.Biol.,399:436-449(2010))。众所周知，含有Fc的全长双特异性抗体形式具有较长半衰期，并且具备Fc效应功能。然而，全长双特异性抗体需要采用杵臼-孔洞(knobs-into-holes)(“KiH”)技术(Ridgway等，ProteinEng.，9：617-621(1996))来提高Fc区的异二聚化组装和稳定性，但是异源二聚物匹配性差以及轻链错配等，仍会导致目标产物稳定性差以及一系列非目标产物的生成，导致分子表达和纯化的困难。虽然Fc会赋予双特异性抗体较长的半衰期，但其也是干扰异二聚体形成的原因之一，而且Fc效应功能在某些药物设计中不仅不是必需，还会对药物功能产生干扰性影响。因此为了避免Fc效应，一些双特异性抗体采用单链形式，如BiTE、双链抗体、DART和TandAb，通过肽接头连接不同的可变结构域以实现双特异性。与全尺寸单克隆抗体相比，这些分子的优点在于它们更小并且更快地进入组织和肿瘤，缺点是这些形式不含Fc区，分子量通常小于60kDa，会由于肾清除导致非常短的体内半衰期，并且在物理上不稳定(Spiess等(2015)，前述引文)。全长双特异抗体Fc导致非相关重链同二聚体配对的无活性分子副产物的形成，单链双特异性抗体稳定性差半衰期短，则介于这两者之间的双链Fab抗体形式，有望同时克服这些问题。但是，直接将两个或更多个Fab借助一种普通连接物彼此融合的构建体可行性差，原因在于两条轻链的随机缔合仍然会产生无活性、不想要的副产物。已有诸多双特异性或多特异性的抗体形式作为研发新治疗性抗体的可能形式。然而，到目前为止，还没有一种形式可以提供一套全面的特性，从而使其自身可以用于研发治疗大多数疾病的新型治疗性抗体。鉴于双特异性或多特异性的抗体不断增加的可能应用以及与目前可用形式相关的多变结果，仍然需要改进的形式，其可以工程化，以解决与研发治疗特定疾病的抗体相关的特定挑战。专利技术概述本文中提供一种新的双特异性抗体及其制备方法，所述双特异性抗体因错配副产物减少、目标产物增加而容易产生，比本领域已知的双特异性抗体片段显示更高的稳定性和更少的聚集。而且，这种方法可以应用于现存的抗体而无需筛选共同轻链或重链。此外，与许多单链双特异性抗体片段相比，这种新的双特异性抗体具有更高的分子量，能够防止过度肾清除从而增加其体内半衰期。在第一方面，本申请提供了一种抗体，其包含：a)能特异性结合第一抗原的Fab片段，其中所述Fab片段由一条轻链以及一条重链的CH1和可变区组成；b)第一肽接头，所述第一肽接头的N端与所述重链融合；c)第二肽接头，所述第二肽接头的N端与所述轻链融合，其中所述第一肽接头和所述第二肽接头之间仅能形成一个二硫键，并且各自独立地选自以下：包含SeqIDNO.1-2所示序列中的任一种的肽接头，其中SeqIDNO.1-2分别为XPPCPAPE和EPAPCPPX，并且其中X代表除Cys的任意氨基酸，或者缺失。在第二方面，本申请提供了编码第一方面所述的抗体的核酸。在第三方面，本申请提供了包含第二方面所述的核酸的表达载体。在第四方面，本申请提供了一种宿主细胞，其包含第二方面所述的核酸或第三方面所述的表达载体。在一些实施方案中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。哺乳动物细胞可以包括但不限于CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞和PER.C6细胞。在第五方面，本申请提供了制备第一方面所述的抗体的方法，其包括：a)培养第四方面所述的宿主细胞；和b)从所述宿主细胞中或所述宿主细胞的培养物上清中回收所述抗体。在第六方面，本申请提供了药物组合物，其包含第一方面所述的抗体，第二方面所述的核酸，第三方面所述的表达载体或第四方面所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体。在第七方面，本申请提供了第一方面所述的抗体，第二方面所述的核酸，第三方面所述的表达载体或第四方面所述的宿主细胞在本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种抗体，其包含：/na)能特异性结合第一抗原的Fab片段，其中所述Fab片段由一条轻链以及一条重链的CH1和可变区组成；/nb)第一肽接头，所述第一肽接头的N端与所述重链融合；/nc)第二肽接头，所述第二肽接头的N端与所述轻链融合，/n其中所述第一肽接头和所述第二肽接头之间仅能形成一个二硫键，并且各自独立地选自以下：包含Seq ID NO.1-2所示序列中的任一种的肽接头，其中X代表除Cys的任意氨基酸，或者缺失，任选地，所述第一肽接头和/或所述第二肽接头可以为天然抗体的铰链区，其中可以对铰链区进行仅保留一个半胱氨酸的缺失突变，任选地，所述第一肽接头和/或所述第二肽接头为C229缺失突变的IgG1铰链区。/n
【技术特征摘要】
1.一种抗体，其包含：
a)能特异性结合第一抗原的Fab片段，其中所述Fab片段由一条轻链以及一条重链的CH1和可变区组成；
b)第一肽接头，所述第一肽接头的N端与所述重链融合；
c)第二肽接头，所述第二肽接头的N端与所述轻链融合，
其中所述第一肽接头和所述第二肽接头之间仅能形成一个二硫键，并且各自独立地选自以下：包含SeqIDNO.1-2所示序列中的任一种的肽接头，其中X代表除Cys的任意氨基酸，或者缺失，任选地，所述第一肽接头和/或所述第二肽接头可以为天然抗体的铰链区，其中可以对铰链区进行仅保留一个半胱氨酸的缺失突变，任选地，所述第一肽接头和/或所述第二肽接头为C229缺失突变的IgG1铰链区。
2.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体还包含第一结合部分，所述第一结合部分与所述第一肽接头的C-端融合，任选地，所述抗体还包含第二结合部分，所述第二结合部分与所述第二肽接头的C-端融合。
3.如权利要求2所述的抗体，其中所述第一结合部分选自能特异性结合第二抗原的抗体或其抗原结合片段、配体和受体，任选地，所述第二结合部分选自能特异性结合第三抗原的抗体或其抗原结合片段、配体和受体，任选地，所述抗原结合片段选自Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、双体和单链抗体分子如sc-Fv，任选地，其中所述第一肽接头和所述第二肽接头相同或者不同，任选地，所述第一结合部分和所述第二结合部分相同或者不同。
4.根据权利要求1-3中任一项的抗体，其中所述抗体是双特异性的或多特异性的，任选地所述抗体是二价的或者多价的，任选地，所述第一抗原、第二抗原和第三抗原独立地选自TNFα、IL17、CD137、CD3、CD19和PD-L1，任选地，...
【专利技术属性】
技术研发人员：高新，钱尼良，李宏杰，杨翠马，王富玉，潘秀颉，刘蕴慧，胡冬梅，
申请(专利权)人：北京免疫方舟医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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