由两个炭疽非保护性抗体组成的新型双特异保护性抗体制造技术

本发明专利技术公开了一种由两个炭疽非保护性抗体组成的新型双特异保护性抗体，所述抗体的重链和轻链的可变区分别由抗炭疽杆菌PA抗原两个不同表位的可变区串联组成，所述重链和轻链的可变区均具有独特的CDR区。本发明专利技术提供的双特异性抗体通过亲本抗体的筛选和组合，引入了新的中和机制，具有浓度依赖的furin酶切PA83抑制活性以及LF切割MEK抑制活性，具有比亲本抗体单独或者混合使用更显著的抗体中和活性和动物保护率，显示其在制备用于治疗和/或预防炭疽芽胞杆菌感染疾病药物中的良好应用前景。

A new double specific protective antibody composed of two non protective antibodies against anthrax

【技术实现步骤摘要】
由两个炭疽非保护性抗体组成的新型双特异保护性抗体
本专利技术公开了一种双特异抗体，属于多肽
，更具体地，属于免疫球蛋白

技术介绍
炭疽杆菌(Bacillusanthracis)是一种革兰氏阳性的芽胞杆菌。炭疽芽胞杆菌是一种在世界范围内流行的人畜共患致死性传染病-炭疽病的病原体。炭疽病通常在一些蹄类动物中传播，人类感染炭疽的主要原因是与动物或者畜产品频繁接触。临床中人类炭疽病按照其感染途径可分为三种：皮肤炭疽、胃肠炭疽和吸入性炭疽，三种炭疽病均可能造成死亡，而其中吸入性炭疽致死率高达90％。虽然炭疽病在人类中自然传播的发生率较低，但是由于炭疽杆菌的芽胞极强的存活能力，且致死率极高、来源广泛、成本低廉、易于培养，因此多年来炭疽芽胞杆菌一直被作为一种潜在的生物武器进行管控，美国将其列为A类生物战剂。2001年美国发生的炭疽邮件攻击事件，造成22例炭疽感染，其中5例病患最终死亡，并且数千人被列为潜在感染人群，炭疽攻击事件所带来的生物威胁一度引起全世界的恐慌。近年来随着国际反恐的发展，对炭疽的防控研究已成为国际生物医学界的研究热点之一。炭疽芽胞杆菌的主要致病因子包括三种毒素蛋白和以γ键相联结的聚-D-谷氨酰荚膜，其中荚膜能够阻止细菌被宿主免疫细胞吞噬，而毒素是造成宿主损伤和死亡的主要原因。炭疽杆菌分泌的三种毒素蛋白分别是保护性抗原(PA83kDa)，致死因子(LF85kDa)和水肿因子(EF89kDa)。毒素LF是具有锌金属蛋白酶活性，能够激活靶细胞的MAPK信号途径。毒素EF具有腺苷酸环化酶活性，通过钙调蛋白的激活，使靶细胞的cAMP浓度升高。毒素PA能够与靶细胞表面受体(CMG-2/TEM-8)结合，靶细胞膜上的Furin酶切除PA(PA83)氨基端20kDa(PA20)肽段后，留在细胞膜上的63kDa(PA63)肽段发生寡聚化，形成的七聚体最多结合三个LF或者EF，PA与LF形成的复合物称为致死毒素(LT)，PA与EF形成的毒素称为水肿毒素(ET)，PA与LF或EF形成的复合物通过内吞作用进入胞内并释放LF和EF，发挥LF和EF的毒性作用。可见PA在炭疽芽胞杆菌毒素侵染宿主的过程，并最终造成宿主细胞伤害或死亡中起到了至关重要的作用。PA蛋白的空间结构由四个结构域构成：PA结构域1(1～258位氨基酸残基)中包含Furin酶的作用位点；PA结构域2(259～487位氨基酸残基)在PA由孔前蛋白转变为孔蛋白释放LF/EF的过程发挥重要作用；PA结构域3(488～595位氨基酸残基)是PA63自发聚合成七聚体的重要功能区域；PA结构域4(596～735位氨基酸残基)是PA与细胞表面受体结合的区域。四个结构域相互作用共同为PA发挥生物学功能起着不可替代的作用。1.炭疽芽胞杆菌的防治手段炭疽的医学防护措施主要有预防和治疗两方面。PA在炭疽芽胞杆菌侵染宿主细胞的过程中发挥了不可替代的中心作用，研究表明以PA作为靶点的炭疽预防和治疗手段是非常安全有效的。目前炭疽的预防主要是接种炭疽疫苗，美国FDA唯一批准的炭疽疫苗AVA(AnthraxVaccineAdsorbed)和英国使用的炭疽疫苗AVP(AnthraxVaccinePrecipitated)，都是以PA作为主要免疫活性成分。研究和实践表明，AVA和AVP疫苗能够有效激发人类和动物针对炭疽的保护性免疫。然而，AVA和AVP疫苗应用于炭疽预防仍存在一定问题：疫苗产生保护性免疫的窗口期长，难以满足暴露后预防的需求；疫苗中同时含有三种毒素因子，对人体安全是一种潜在的威胁；疫苗产品批次间效果一致性差；难以保存。近年来新兴的新一代炭疽疫苗重组PA疫苗，能够更快地激发人体保护性免疫反应，成分单一且更容易保证批次之间的一致性。重组PA疫苗的临床研究已经证明了其安全性和有效的免疫原性。目前炭疽的治疗主要依靠抗菌素，多种抗菌素对炭疽有效，但如出现以下情况，临床上往往不能奏效：①未能及时服用抗菌素：抗菌素一般需要在机体接触炭疽芽胞后的48小时内使用，即繁殖体阶段使用，可以有效治疗，但炭疽感染的潜伏期可以持续数小时甚至几天，这一阶段的症状表现类似流感，易误诊，错过最佳治疗时机；②人体耐药性：抗生素滥用使部分人群对多种抗生素产生抗药性，一些个体对许多抗菌素已产生抗药性，使得抗菌素治疗无效；③炭疽杆菌的人为改构：将抗生素抗性基因导入炭疽杆菌使抗生素失效，在技术上已完全可能(前苏联曾研制出具有18种抗生素抗性的超级炭疽杆菌)。抗生素在繁殖体阶段若不能有效阻断炭疽感染，一旦进入毒素阶段，抗生素就毫无作用。抗生素对吸入性炭疽的治疗虽然有效，但必须在感染初期立即使用。抗生素只能杀死人体组织内的部分芽胞和细菌，却不能抵抗细菌在体内产生的大量毒素。而在感染晚期由于毒素的大量产生，仍会导致患者死亡。目前国外的研究主要集中在发现能抵抗炭疽毒素的药物方面，包括中和单抗、可溶性受体、PA突变体和小分子抑制剂等。中和抗体因具有保护性高，在人体内可以发挥特有的补体依赖细胞毒作用(CDC)和抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)，半衰期长，性质稳定等优点，尤其将中和抗体与抗生素联合应用时，可以相互弥补，最大可能发挥治疗作用，因此中和抗体已成为目前最有前景的炭疽治疗药物。单克隆抗体药物主要通过结合一个特定的表位，起到一定的生物学功能，诸如阻断蛋白相互作用，激活或调节受体功能；抗体的Fc片段还能起到诱导ADCC或CDC效果。自1986年第一个抗体上市以来，FDA和EMA分别批准了55个和62个治疗性抗体药物(含生物类似药，不含Fc融合蛋白)，临床应用不断增加。针对炭疽保护性抗原的单抗药物有了较为深入的研究，同时也明确了这些单抗所针对的抗原中和表位。已有的研究表明，抗LF/EF抗体能阻断LT/ET发挥活性，保护动物抵抗炭疽毒素或者炭疽芽胞的攻击。但是无论是被动免疫还是治疗，效果均不及抗PA抗体。抗PA中和性抗体的作用要比针对炭疽毒素其他组分的中和性抗体更加重要。在感染初期，因荚膜表面有PA的存在，抗PA抗体能与芽胞结合，增强巨噬细胞的吞噬作用，抑制出芽或通过氧化杀死正在出芽的芽胞，因此，抗PA抗体具有抗芽胞的活性。芽胞被巨噬细胞吞噬后，导致巨噬细胞裂解，释放繁殖体，并伴有一定量的PA、LF及EF的分泌表达，蛋白酶水解PA，装配成七聚体，结合LF和EF后内吞入细胞发挥毒素作用。抗PA抗体可以通过抑制PA装配或与细胞结合来发挥作用。研究显示，针对炭疽PA的单克隆抗体能够保护细胞免受炭疽毒素和炭疽芽胞杆菌的攻击，特别是对吸入性炭疽具有保护作用。报道的已明确中和表位的单抗数量众多，还有大量未解析抗原表位的中和单抗尚在研究当中。Siu-KeiChow等人在研究过程中发现了一些非中和抗体，甚至单独使用时具有毒素增强功能，但这种抗体却能够协助中和抗体发挥更好的效果，研究强调了非中和抗体在炭疽治疗中的重要性。然而，针对非中和单抗以及非中和表位的研究一直以来少见报道。由于生物恐怖的潜在威胁，人工改造炭疽毒素对于已知抗体的中和表位也存在可能，因此将针对非中和表位的炭疽抗体充分合理应用，能够为炭疽的治疗提供更多可供选本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种由两个炭疽非保护性抗体组成的新型双特异保护性抗体，其特征在于，所述抗体的重链和轻链的可变区分别由抗炭疽杆菌PA抗原两个不同表位的可变区串联组成，所述抗体重链的第一可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1第26-35位氨基酸残基所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：1第53-59位氨基酸残基所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO：1第98-110位氨基酸残基所示，所述抗体重链的第二可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQID NO：5第26-33位氨基酸残基所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：5第51-58位氨基酸残基所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：5第97-116位氨基酸残基所示，以及/n所述抗体轻链的第一可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：3第27-32位氨基酸残基所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：3第50-52位氨基酸残基所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：3第89-97位氨基酸残基所示，所述抗体轻链的第二可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：7第27-32位氨基酸残基所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：7第50-52位氨基酸残基所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：7第89-96位氨基酸残基所示。/n...

【技术特征摘要】
1.一种由两个炭疽非保护性抗体组成的新型双特异保护性抗体，其特征在于，所述抗体的重链和轻链的可变区分别由抗炭疽杆菌PA抗原两个不同表位的可变区串联组成，所述抗体重链的第一可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQIDNO：1第26-35位氨基酸残基所示，CDR2的氨基酸序列如SEQIDNO：1第53-59位氨基酸残基所示，CDR3的氨基酸序列如SEQIDNO：1第98-110位氨基酸残基所示，所述抗体重链的第二可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQIDNO：5第26-33位氨基酸残基所示，CDR2的氨基酸序列如SEQIDNO：5第51-58位氨基酸残基所示，CDR3的氨基酸序列如SEQIDNO：5第97-116位氨基酸残基所示，以及
所述抗体轻链的第一可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQIDNO：3第27-32位氨基酸残基所示，CDR2的氨基酸序列如SEQIDNO：3第50-52位氨基酸残基所示，CDR3的氨基酸序列如SEQIDNO：3第89-97位氨基酸残基所示，所述抗体轻链的第二可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQIDNO：7第27-32位氨基酸残基所示，CDR2的氨基酸序列如SEQIDNO：7第50-52位氨基酸残基所示，CDR3的氨基酸序列如SEQIDNO：7第89-96位氨基酸残基所示。


2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体重链的第一可变区的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，所述抗体重链的第二可变区的氨基酸序列如SEQIDNO：5所示，以及
所述抗体轻链的第一可变区的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示，所述抗体轻链的第二可变区的氨基酸序列如SEQIDNO：7所示。


3.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述抗体重链的恒定区的氨基酸序列如SEQIDNO：9所示。


4.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述抗体轻链的恒定区的氨基酸序列如SEQIDNO：11...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈薇，迟象阳，于长明，李建民，徐俊杰，付玲，房婷，张军，陈旖，王美荣，陈郑珊，刘威岑，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11