一种双特异性抗体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种双特异性抗体及其制备方法与应用。本发明专利技术的双特异性抗体包含能结合CD20的结构域、能结合CD3的结构域和异源二聚体Fc区域，所述能结合CD20的结构域和能结合CD3的结构域各自独立地选自Fab区域、ScFv区域或sDab区域。本发明专利技术的双特异性抗体能稳定、高效靶向CD20和CD3，并能够介导T细胞特异性杀伤肿瘤细胞。

A bispecific antibody and its preparation and Application

The invention relates to a bispecific antibody and a preparation method and application thereof. The bispecific antibody of the invention comprises a domain capable of binding CD20, a domain capable of binding CD3 and a heterodimer Fc region, wherein the domain capable of binding CD20 and the domain capable of binding CD3 are independently selected from the Fab region, the scFv region or the sdab region. The bispecific antibody of the invention can stably and efficiently target CD20 and CD3, and can mediate T cell specific killing of tumor cells.

【技术实现步骤摘要】
一种双特异性抗体及其制备方法与应用
本专利技术涉及一种抗体及其制备方法与应用，具体涉及一种双特异性抗体及其制备方法与应用。
技术介绍
B细胞表面的特异性抗原如CD19、CD20、CD22、CD52等是B细胞相关性疾病的潜在治疗靶点，其中CD20蛋白又被叫做B淋巴细胞限制性分化抗原、Bp35或B1，是人MS4A1基因所编码表达的四次跨膜、高度疏水的非糖基化磷蛋白，分子量为35kD左右[1-3](StashenkoP,etal.JImmunol1980,125(4):1678-1685；EinfeldDA,etal.EMBOJ1988,7(3):711-717；OettgenHC,etal.Hybridoma1983,2(1):17-28)。CD20特异性地表达于前B细胞以及成熟的B细胞表面，但在造血干细胞、祖细胞、浆细胞和其他正常体细胞中不表达。CD20还同时表达于B细胞淋巴瘤如：非霍奇金淋巴瘤(NHL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)等细胞表面[4](NadlerLM,etal.JClinInvest1981,67(1):134-140)。CD20没有已知的天然配体，研究表明，CD20具有钙离子通道活性，通过调控细胞内钙离子浓度调节细胞周期，在B细胞激活即从G0期进入G1期的分化和生长过程中发挥特殊作用，同时调节细胞周期从S期进入有丝分裂期，也能诱导细胞凋亡[5,6](TedderTF,etal.ImmunolToday1994,15(9):450-454；BubienJKZL,etal.JCellBiol1993,121(5):1121-1132)。由于CD20特异性地表达于多种B细胞相关的淋巴瘤细胞表面，前B细胞和其他体细胞上没有CD20的表达，并且CD20不轻易脱落或分泌，与抗体结合后不发生内吞，是治疗B细胞相关疾病非常具有潜力的理想靶点。目前针对CD20的治疗性单克隆抗体类药物有多种已上市，根据作用机理可将其分为两类：TypeI和TypeII，TypeI类抗体主要通过CDC(补体依赖的细胞毒性作用)和ADCC(抗体依赖的细胞毒性作用)发挥功能，TypeII类主要通过PCD(程序性细胞死亡)和ADCC发挥功能[7](MeyerS,etal.BrJHaematol2018,180(6):808-820)。人鼠嵌合抗体利妥昔单抗(Rituximab，商品名：Rituxian/美罗华)为第一代CD20抗体(TypeI)，1997年被FDA批准用于治疗NHL，随后又被批准用于治疗类风湿性关节炎、CLL等疾病；全人源单抗奥法木单抗(Ofatumumab，商品名：Arzerra)为第二代CD20抗体(TypeI)，与美罗华相比，奥法木单抗对CD20的亲和力更强，细胞试验显示CDC反应也更强，ADCC反应与美罗华类似，于2009年被FDA加速批准用于治疗氟达拉滨或阿仑单抗治疗无效的CLL，后又被批准用于治疗滤泡淋巴瘤、视神经脊髓炎、弥漫性和复发性多发性硬化症等疾病；人源化单抗Obinutuzumab单抗(商品名：Gazyva)为第三代CD20抗体(TypeII)，由于经过了糖基化改造，增强了抗体与NK细胞、巨噬细胞和树突状细胞的亲和力，因而比美罗华有更强的ADCC反应，同时Obinutuzumab单抗通过中性粒细胞导致的胞吞作用和细胞死亡能更有效地诱导B细胞凋亡[8](GolayJ,etal.Blood2013,122(20):3482-3491)，2013年被FDA批准与苯丁酸氮芥联合治疗过往未接受治疗的CLL。与传统化疗方式相比，针对CD20靶点的单抗药物在临床上显示了更好的临床优势，但往往需要与化学药物联用，而且不是所有患者都能对CD20抗体疗法产生响应。这是由于CD20单抗的疗效与肿瘤细胞上CD20的表达水平相关，某些类别如CLL细胞上的CD20表达水平显著低于其他类别的B细胞肿瘤，限制了CD20单抗的疗效[9](PrevodnikVK,etal.DiagnPathol2011,6:33)。另外，单抗主要是通过结合FcγR产生的ADCC、ADCP、CDC等作用机制杀伤肿瘤细胞，而FcγR在人群中具有多态性，导致了FcγR对Fc的亲和力有显著的差异，降低了药物的总体有效性，导致复发并产生耐药性，一旦复发，治疗难度会更大，预后极差，中位生存期只有2-8个月[10,11](BowlesJA,etal.JImmunolMethods2005,304(1-2):88-99；VeeramaniS,etal.Blood2011,118(12):3347-3349)。具有高效肿瘤杀伤效果的T细胞因为没有FcγR而无法被有效激活，为此，需要设计更有效的临床抗体药物来满足目前的治疗形势，比如激活T细胞从而更加高效地杀伤肿瘤细胞，或者开发同时结合两个或多个抗原靶点的多功能抗体。双特异性抗体由于能同时结合两种抗原表位或者一种抗原的两个表位，通过协同作用，可以达到更高的效能(potency)；有些双特异抗体可以将效应细胞(如T细胞)等招募至目标靶点，通过激活T细胞直接杀伤靶细胞。当前双特异抗体的安全性和有效性得到了很大的改善，被广泛应用于肿瘤、自身免疫疾病的治疗，是肿瘤免疫治疗的一个研发热点，具有广阔的应用前景。在治疗恶性肿瘤的实际应用中，双特异抗体通常同时结合肿瘤细胞表面抗原以及免疫细胞表面抗原，通过激活自身免疫系统杀伤肿瘤细胞(ChamesP,etal.CurrOpinDrugDiscovDevel2009,12:276-283)。CD3是同源或异源二聚体蛋白复合物，是构成T细胞受体(TCR)的重要组成成分，其胞内区域含有免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)，当ITAM磷酸化后会与激酶ZAP70结合，从而向下游转导T细胞激活信号。靶向CD3的抗体能够在T细胞表面聚集CD3，从而激活T细胞，这一过程模拟了TCR识别MHC-抗原肽的过程。具有CD3抗性和肿瘤特异性抗原抗性的双特异性抗体能够同时结合T细胞和肿瘤细胞，激活并引导T细胞分泌颗粒酶、穿孔素等杀伤肿瘤细胞，例如同时结合CD20和CD3分子的双特异性抗体，能够将T细胞招募至表达CD20蛋白的肿瘤细胞处，导致CD20阳性的肿瘤细胞被杀伤清除。早期的双特异性抗体大多是通过已纯化好的单抗化学交联或表达两种不同单抗的杂交瘤细胞融合产生，但这些方法生产的产品会有许多问题如产物不稳定、产量低下、抗体修饰不当、免疫原性、生产纯化困难等[12,13](MilsteinC,etal.Nature1983,305(5934):537-540；MilsteinC,etal.ImmunolToday1984,5(10):299-304)。随着近些年基因工程技术的进步，BsAb大量通过基因工程技术制备，目前已有超过60种不同的双特异性抗体形式，总体可以分为两类：不包含Fc以及包含Fc区域的双特异性抗体[14](BrinkmannU,etal.mAbs2017,9(2):182-212)。不包含Fc的双特异抗体，例如：BiTE、DART、TandAbs、Bi-Nanobody等，分子量小、可以在原核细胞中实现表本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包含能结合CD20的结构域、能结合CD3的结构域和异源二聚体Fc区域，所述能结合CD20的结构域和能结合CD3的结构域各自独立地选自Fab区域、ScFv区域或sDab区域。/n

【技术特征摘要】
1.一种双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包含能结合CD20的结构域、能结合CD3的结构域和异源二聚体Fc区域，所述能结合CD20的结构域和能结合CD3的结构域各自独立地选自Fab区域、ScFv区域或sDab区域。


2.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述能结合CD20的结构域包括第一免疫球蛋白Fab区域，所述第一免疫球蛋白Fab区域主要由相互结合的第一重链与第一轻链形成，所述第一重链的可变区具有如SEQIDNo.:2所示的氨基酸序列，所述第一轻链的可变区具有如SEQIDNo.:4所示的氨基酸序列；和/或所述能结合CD3的结构域包括第二免疫球蛋白Fab区域，所述第二免疫球蛋白Fab区域主要由相互结合的第二重链与第二轻链形成，所述第二重链的可变区具有如SEQIDNo.:6所示的氨基酸序列，所述第二轻链的可变区具有如SEQIDNo.:10所示的氨基酸序列；
所述异源二聚体Fc区域由两条多肽链构成，每条多肽链包含带相反电荷的不对称氨基酸修饰。


3.如权利要求2所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一重链的CH1部分以及第一轻链的CL部分均包含一个取代天然半胱氨酸残基的非半胱氨酸残基，以及一个取代非天然半胱氨酸的半胱氨酸残基。


4.如权利要求3所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一重链的CH1部分中取代天然半胱氨酸残基的非半胱氨酸残基与第一轻链的CL部分中取代非天然半胱氨酸的半胱氨酸残基形成二硫键。


5.如权利要求3所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一重链的CH1部分中，取代天然半胱氨酸残基的非半胱氨酸残基为C220S，取代非天然半胱氨酸的半胱氨酸残基为L128C。


6.如权利要求3所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一轻链的CL部分中，取代天然半胱氨酸残基的非半胱氨酸残基为C214S，取代非天然半胱氨酸的半胱氨酸残基为F118C。


7.如权利要求2所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第二免疫球蛋白Fab区域不包含取代天然半胱氨酸残基的非半胱氨酸残基，且不包含取代非天然半胱氨酸残基的半胱氨酸残基。


8.如权利要求2所述的双特异性抗体，其特征在于，所述能结合CD20的结构域包括第一免疫球蛋白Fab区域，所述能结合CD3的结构域包括第二免疫球蛋白Fab区域；所述第一重链与第二重链相互结合，形成异源二聚体Fc区域。


9.如权利要求8所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一重链和第二重链来自人抗体IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。


10.如权利要求8所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一重链具有如SEQIDNo.:1所示的氨基酸序列，第一轻链具有如SEQIDNo.:3所示的氨基酸序列，所述第二重链具有如SEQIDNo.:5或SEQIDNo.:7所示的氨基酸序列，第二轻链具有如SEQIDNo.:9所示的氨基酸序列。


11.如权利要求2所述的双特异性抗体，其特征在于，所述能结合CD2...

【专利技术属性】
技术研发人员：张文军，李峰，华亚南，刘嘉熙，方春华，
申请(专利权)人：广州爱思迈生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44