一种滴滴涕单克隆抗体的制备及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种滴滴涕单克隆抗体的制备方法，并将其应用于滴滴涕残留检测试纸条和酶联免疫试剂盒。试纸条包括：样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)和底板(7)，所述反应膜上具有包被有滴滴涕半抗原‑载体蛋白偶联物的检测线(5)和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线(6)，所述结合物释放垫(2)喷涂有滴滴涕单克隆抗体‑胶体金标记物。试剂盒包括：包被有包被原的酶标板、滴滴涕标准品溶液、滴滴涕抗体、酶结合物浓缩液、酶结合物稀释液、底物显色液、终止液、洗涤液，所述包被原为滴滴涕偶联抗原，所述酶结合物为酶标记的滴滴涕抗体。本发明专利技术所提供的试纸条和酶联免疫试剂盒具有操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低等特点，适合大量样本的筛查和现场监控。

Preparation and application of a monoclonal antibody against DDT

The invention discloses a preparation method of DDT monoclonal antibody, and applies it to DDT residue detection test strip and enzyme-linked immune kit. The test strip includes: a sample absorption pad (1), a binding release pad (2), a reaction membrane (3), a water absorption pad (4) and a base plate (7). The reaction membrane is provided with a detection line (5) coated with a DDT hapten \u2011 carrier protein conjugate and a quality control line (6) coated with a Sheep anti mouse antibody. The binding release pad (2) is coated with a DDT monoclonal antibody \u2011 colloidal gold marker. The kit includes: an enzyme standard plate, a DDT standard solution, a DDT antibody, an enzyme binding concentrate, an enzyme binding diluent, a substrate color developing solution, a termination solution and a washing solution. The kit is originally a DDT coupling antigen, and the enzyme binding is an enzyme labeled DDT antibody. The test strip and ELISA kit provided by the invention have the advantages of simple operation, high sensitivity, fast detection speed and low cost, and are suitable for screening and on-site monitoring of a large number of samples.

【技术实现步骤摘要】
一种滴滴涕单克隆抗体的制备及其应用
本专利技术涉及一种滴滴涕单克隆抗体的制备及其应用，具体涉及一种滴滴涕单克隆抗体的制备方法，其特别适用于蔬菜、水果等农作物中滴滴涕残留的检测。
技术介绍
滴滴涕(DDT)曾是广泛使用的杀虫剂之一，具有胃毒和触杀作用，可加工成粉剂、乳剂或油剂使用。我国以前主要用于防治棉蕾铃期害虫，果树食心虫，农田作物粘虫、蔬菜菜青虫等，也用于环境了卫生，防治蚊、蝇、臭虫等。DDT不易被降解成无毒物质，使用中易造成积累从而污染环境。残留于植物中的DDT，可通过“食物链”或其他途径进入人和动物体内，沉积中毒，影响人体健康。虽然该药物已被禁止使用多年，但是有一些养殖户仍然违规使用，因此，检测该农药是必要的。目前检测滴滴涕的方法大都是仪器方法，仪器成本高，检测时间长，操作复杂，不符合基层实验室的高效、便捷的检测要求，因此，本专利技术制备出一种滴滴涕的单克隆抗体，应用于胶体金试纸条、酶联免疫试剂盒等快速检测产品的制备，能够适应基层实验室的检测需求，有利于提高监管手段和监督水平。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种滴滴涕单克隆抗体的制备方法，并将其应用于滴滴涕残留检测试纸条和酶联免疫试剂盒。本专利技术所提供的滴滴涕单克隆抗体是以滴滴涕半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，是由滴滴涕单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌获得；所述羊抗鼠抗抗体是将鼠源抗体免疫羊得到；所述滴滴涕半抗原-载体蛋白偶联物是由滴滴涕半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。本专利技术所提供的检测滴滴涕残留的试纸条，包括样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)和底板(7)；所述反应膜上具有包被有滴滴涕半抗原-载体蛋白偶联物的检测线(5)和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线(6)，所述结合物释放垫(2)喷涂有滴滴涕单克隆抗体-胶体金标记物。所述样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)依次粘贴在底板(7)上，所述结合物释放垫1/3～1/2被覆盖于样品吸收垫下。所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；所述结合物释放垫可为玻璃棉或聚酯材料；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。本专利技术所提供的检测滴滴涕残留的酶联免疫试剂盒，包括：包被有包被原的酶标板、滴滴涕标准品溶液、滴滴涕抗体、酶结合物浓缩液、酶结合物稀释液、底物显色液、终止液、洗涤液，所述包被原为滴滴涕偶联抗原，所述酶结合物为酶标记的滴滴涕抗体。所述滴滴涕特异性抗体是以滴滴涕偶联抗原作为免疫原制备获得，所述滴滴涕特异性抗体可为滴滴涕单克隆抗体或滴滴涕多克隆抗体，其中优选滴滴涕单克隆抗体。所述酶结合物的标记酶为辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶，其中优选辣根过氧化物酶；酶结合物是由酶和滴滴涕抗体偶联得到的。本专利技术的滴滴涕快速检测试纸条采用高度特异性的抗体抗原反应及竞争抑制免疫层析分析技术，将滴滴涕单克隆抗体-胶体金标记物固定于结合物释放垫上，样品中的滴滴涕在流动过程中，与结合物释放垫上的滴滴涕单克隆抗体-胶体金标记物结合，形成药物-抗体-胶体金标记物。样本中的药物与反应膜检测线上的滴滴涕半抗原-载体蛋白偶联物竞争结合滴滴涕单克隆抗体-胶体金标记物，根据检测线红色条带有无或颜色深浅来判断待测样品液中是否含有滴滴涕残留。本试剂盒采用直接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的滴滴涕和酶标板微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗滴滴涕的酶结合物，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含残留物滴滴涕的含量成负相关，与标准曲线比较，再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样本中滴滴涕的残留量。本专利技术的试纸条和试剂盒具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。用本专利技术试纸条和试剂盒检测滴滴涕残留的方法简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。附图说明图1为滴滴涕半抗原合成图。具体实施方式下面结合具体的实施例来进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术，而不用来限制本专利技术的范围。实施例1滴滴涕单克隆抗体的制备1、滴滴涕半抗原的制备取1.7g邻氯苯乙酸，加5ml氯苯，加入1.8g水合氯醛，加热，完全溶解后，加入三氯化铝5.38g，室温搅拌5h，停止反应，加水80ml，乙酸乙酯120ml，萃取分离，分去水相，有机相无水硫酸钠干燥蒸干，得到黄色油状物，上硅胶柱，石油醚/乙酸乙酯(v/v，1/1)洗脱分离，得到乙酸滴滴涕半抗原产物1.8g，收率43.9％。2、免疫原的制备取乙酸滴滴涕半抗原产物15mg，加DMF1ml，溶解澄清，加EDC13.7mg，加NHS10.9mg，充分混匀后，反应4h，得到半抗原活化液A液；取牛血清白蛋白(BSA)50mg,加0.05MPB溶解，得到B液，将A液滴加到B液中，4℃反应24h，0.02MPBS透析纯化三天，每天换液3次，得到滴滴涕-BSA偶联物，即为免疫原，分装，-20℃保存。3、包被原的制备取乙酸滴滴涕半抗原产物9mg，加DMF1ml，溶解澄清，加EDC7.6mg，加NHS6.8mg，充分混匀后，反应4h，得到半抗原活化液A液；取卵清白蛋白(OVA)50mg,加0.05MPB溶解，得到B液，将A液滴加到B液中，4℃反应24h，0.02MPBS透析纯化三天，每天换液3次，得到滴滴涕-OVA偶联物，即为免疫原，分装，-20℃保存。4、滴滴涕单克隆抗体的制备(1)动物免疫将步骤2得到的免疫原注入Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。(2)细胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按8:1(数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。(3)细胞冻存和复苏将杂交瘤细胞用冻存液制成1×106个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。(4)单克隆抗体的制备与纯化增量培养法：将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。所述细胞培养基为向RPMI1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20％(质量分数)，碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2％(质量分数)；所述细胞培养基的pH为7.4。5、羊抗鼠抗抗体的制备以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。实施例2滴滴涕残留试纸条的制备该试纸条的制备方法主本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种滴滴涕单克隆抗体，其特征在于所述单克隆抗体由滴滴涕半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，所述半抗原的制备方法为：取1.7g邻氯苯乙酸，加5ml氯苯，加入1.8g水合氯醛，加热，完全溶解后，加入三氯化铝5.38g，室温搅拌5h，停止反应，加水80ml，乙酸乙酯120ml，萃取分离，分去水相，有机相无水硫酸钠干燥蒸干，得到黄色油状物，上硅胶柱，石油醚/乙酸乙酯体积比1:1洗脱分离，得到乙酸滴滴涕半抗原产物1.8g，收率43.9％。/n

【技术特征摘要】
1.一种滴滴涕单克隆抗体，其特征在于所述单克隆抗体由滴滴涕半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，所述半抗原的制备方法为：取1.7g邻氯苯乙酸，加5ml氯苯，加入1.8g水合氯醛，加热，完全溶解后，加入三氯化铝5.38g，室温搅拌5h，停止反应，加水80ml，乙酸乙酯120ml，萃取分离，分去水相，有机相无水硫酸钠干燥蒸干，得到黄色油状物，上硅胶柱，石油醚/乙酸乙酯体积比1:1洗脱分离，得到乙酸滴滴涕半抗原产物1.8g，收率43.9％。


2.如权利要求1所述的滴滴涕单克隆抗体，其特征在于所述滴滴涕半抗原的分子结构式为：





3.如权利要求1所述的滴滴涕单克隆抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：何方洋，万宇平，吴小胜，贾芳芳，崔海峰，凡静静，赵正苗，
申请(专利权)人：北京勤邦生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11