一种己烯雌酚单克隆抗体及酶联免疫试剂盒的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种己烯雌酚单克隆抗体及酶联免疫试剂盒的制备方法。本发明专利技术所提供的酶联免疫试剂盒包括己烯雌酚单克隆抗体、包被原、己烯雌酚标准品溶液；所述己烯雌酚单克隆抗体为己烯雌酚杂交瘤细胞株分泌的抗体；所述包被原为己烯雌酚半抗原与载体蛋白的偶联物。使用该酶联免疫试剂盒进行己烯雌酚残留物的检测操作简单、无需复杂前处理、适合大量样品的高效、快速、准确的检测己烯雌酚检测，且该试剂盒稳定性较高。

A monoclonal antibody against diethylstilbestrol and preparation of ELISA Kit

The invention discloses a preparation method of a diethylstilbestrol monoclonal antibody and an enzyme-linked immunosorbent kit. The enzyme-linked immunosorbent kit provided by the invention includes a diethylstilbestrol monoclonal antibody, a coating agent, and a diethylstilbestrol standard solution; the diethylstilbestrol monoclonal antibody is an antibody secreted by the diethylstilbestrol hybridoma cell line; the coating agent is a coupling of the diethylstilbestrol hapten and the carrier egg white. The enzyme-linked immunosorbent kit is simple in operation, does not need complex pretreatment, and is suitable for a large number of samples of high-efficiency, rapid and accurate detection of diethylstilbestrol, and the stability of the kit is high.

【技术实现步骤摘要】
一种己烯雌酚单克隆抗体及酶联免疫试剂盒的制备方法
本专利技术涉及一种酶联免疫(ELISA)试剂盒，具体地说，涉及一种己烯雌酚单克隆抗体及酶联免疫试剂盒的制备及应用。
技术介绍
为了追求经济效益，过度使用己烯雌酚(Diethylstilbestrol，DES)在动物体内的残留危害也日渐暴露出来，研究发现雌激素残留会对人体造成潜在的致癌、致畸风险。欧盟、美国等西方各国从20世纪70年代先后颁布禁令，将己烯雌酚列为禁用兽药。我国1999年的实施残留监控计划中规定禁止使用己烯雌酚，2002年农业部修订的《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定在所有可食动物组织中不得检出对己烯雌酚及其盐和酯。目前国内己烯雌酚检测主要是采用LC-MS法(高效液相色谱-质谱)或者GC-MS法(气相色谱-质谱)，色谱法灵敏度高、精确性强，但样品前处理复杂、对实验人员要求较高，无法满足大批量样品快速筛查的要求；而ELISA盒操作简便、检测迅速，非常适合大量样品的快速筛选。现在已有商业化的己烯雌酚ELISA试剂盒，主要来自国外公司，且价格不菲。国内科研工作者也在己烯雌酚免疫测定方法上积极探索，但目前的试剂盒稳定性和灵敏度与国外产品还有一定差距。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种己烯雌酚单克隆抗体及酶联免疫试剂盒，操作简单、无需复杂前处理、适合大量样品的高效、快速、准确的检测己烯雌酚检测，且稳定性较高。一种己烯雌酚单克隆抗体及酶联免疫试剂盒的制备方法如下：其中所述酶联免疫试剂盒包括己烯雌酚单克隆抗体、包被原、己烯雌酚标准品溶液；所述己烯雌酚单克隆抗体为己烯雌酚杂交瘤细胞株分泌的抗体；所述包被原为己烯雌酚半抗原与载体蛋白的偶联物。所述己烯雌酚半抗原可以为半抗原己烯雌酚单羧基醚DES-1C，制备方法如下：称取537mg己烯雌酚、276mg碳酸钾(K2CO3)溶于15ml二甲基亚砜(DMSO)中，缓慢加入4ml溴甲酸乙酯，60℃加热避光搅拌6h，冷却置室温后得到混合物；用乙醚萃取该混合物，收集有机层于通风柜中室温下挥干，再经氢氧化钠(NaOH)的乙醇溶液水解，制得己烯雌酚半抗原DES-1C。所述载体蛋白可以为牛血清白蛋白(BSA)；所述包被原的制备方法如下：称取7.0mg己烯雌酚半抗原DES-1C、13.0mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、8.0mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)依次溶于0.6mlDMSO，加入0.5ml2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液，室温搅拌活化5h，得到溶液1；取2ml浓度为5mg/ml的牛血清白蛋白(BSA)用1mlPBS稀释得到溶液2；将溶液1慢慢加入到溶液2，边加边搅拌，室温下搅拌3h。将反应液装入透析袋，用0.01M的PBS透析纯化72h，每8h更换透析液，除去未反应的小分子物质，-20℃保存，作为包被原。所述己烯雌酚杂交瘤细胞株的制备方法如下：将己烯雌酚半抗原与载体蛋白进行偶联制备免疫原，对若干BSLB/c的雌性小鼠进行多次免疫后，取抗血清价效高的小鼠脾脏与骨髓瘤细胞融合，并进行阳克隆筛选，得到可稳定分泌抗己烯雌酚杂交瘤细胞株。所述该试剂盒还包括包被了己烯雌酚抗原的酶标板、酶标二抗、缓冲液、洗涤液、显色液、终止液。所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体(羊抗鼠-HRP二抗)；所述缓冲液为PBS含量为0.01mol/L，PH＝7.4的磷酸盐缓冲液，配方为：8.0gNaCl、3.62gNa2HPO4-12H2O、0.2gKH2PO4和0.2gKCl溶于1L双蒸水中并调节pH为7.4；所述洗涤液为含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液(PBST，0.01mol/L，pH＝7.4)；所述显色液为底物缓冲液与TMB使用液体积比5:1的混合物，所述底物缓冲液为0.1mol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH5.0)，其中100ml中含有180μl30％H2O2，所述TMB使用液为60mgTMB溶于100ml乙二醇；；所述终止液为2mol/L硫酸溶液。一种己烯雌酚单克隆抗体及酶联免疫试剂盒在检测己烯雌酚残留的应用。所述一种己烯雌酚单克隆抗体及酶联免疫试剂盒在检测己烯雌酚残留的应用，主要包括以下步骤：1)样品处理；2)用酶联免疫试剂盒进行检测；3)分析检测结果。所述样品处理包括样品前处理和样品基质效应消除。附图说明图1为SDS-PAGE鉴定结果图；图2为己烯雌酚间接竞争ELISA标准曲线；图3为半抗原DES-1C合成路线；图4为免疫抗原DES-1C-KLH合成路线；图5为DES、KLH、DES-1C-KLH的紫外扫描图谱；图6为DES、BSA、DES-1C-BSA的紫外扫描图谱。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术范围。实施例1试剂盒组分的准备1、半抗原制备称取537mg己烯雌酚、276mg碳酸钾(K2CO3)溶于15ml二甲基亚砜(DMSO)中，缓慢加入4ml溴甲酸乙酯，60℃加热避光搅拌6h，冷却置室温得混合物；用乙醚萃取该混合物，收集有机层于通风柜中室温下挥干，再经氢氧化钠(NaOH)的乙醇溶液水解，制得己烯雌酚半抗原DES-1C。2、抗原的制备与紫外鉴定免疫原制备：将己烯雌酚半抗原与载体蛋白进行偶联，称取7.0mgDES-1C、13.0mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、8.0mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)依次溶于0.6ml二甲基亚砜(DMSO)，加入0.5ml2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液，室温搅拌活化5h，得到溶液3；取2ml浓度为5mg/ml的匙孔蓝蛋白(KLH)用1mlPBS稀释得到溶液4；将溶液1慢慢加入到溶液2，边加边搅拌，室温下搅拌3h。将反应液装入透析袋，用0.01M的PBS透析纯化72h，每8h更换透析液，除去未反应的小分子物质；将DES-1C-KLH透析液冷冻干燥，-20℃保存，作为免疫原。包被原制备：称取7.0mg己烯雌酚半抗原DES-1C、13.0mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、8.0mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)依次溶于0.6mlDMSO，加入0.5ml2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液，室温搅拌活化5h，得到溶液1；取2ml浓度为5mg/ml的牛血清白蛋白(BSA)用1mlPBS稀释得到溶液2；将溶液1慢慢加入到溶液2，边加边搅拌，室温下搅拌3h。将反应液装入透析袋，用0.01M的PBS透析纯化72h，每8h更换透析液，除去未反应的小分子物质，将DES-1C-BSA透析液冷冻干燥，-20℃保存，作为包被原。最后通过紫外扫描初步判定人工抗原耦合成功。3、单克隆抗体制备1)动物免疫：选用6～8周龄的BALB/c雌性小鼠3只，将100μg免疫原DES-1C-KLH以无菌磷酸盐本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种己烯雌酚单克隆抗体及酶联免疫试剂盒的制备方法，其特征在于，所述酶联免疫试剂盒包括己烯雌酚单克隆抗体、包被原、己烯雌酚标准品溶液；所述己烯雌酚单克隆抗体为己烯雌酚杂交瘤细胞株分泌的抗体；所述包被原为己烯雌酚半抗原与载体蛋白的偶联物。/n

【技术特征摘要】
1.一种己烯雌酚单克隆抗体及酶联免疫试剂盒的制备方法，其特征在于，所述酶联免疫试剂盒包括己烯雌酚单克隆抗体、包被原、己烯雌酚标准品溶液；所述己烯雌酚单克隆抗体为己烯雌酚杂交瘤细胞株分泌的抗体；所述包被原为己烯雌酚半抗原与载体蛋白的偶联物。


2.根据权利要求1所述的一种己烯雌酚单克隆抗体及酶联免疫试剂盒的制备方法，其特征在于，所述己烯雌酚半抗原可以为半抗原己烯雌酚单羧基醚DES-1C，制备方法如下：
称取537mg己烯雌酚、276mg碳酸钾（K2CO3）溶于15ml二甲基亚砜（DMSO）中，缓慢加入4ml溴甲酸乙酯，60℃加热避光搅拌6h，冷却置室温后得到混合物；用乙醚萃取该混合物，收集有机层于通风柜中室温下挥干，再经氢氧化钠(NaOH)的乙醇溶液水解，制得己烯雌酚半抗原DES-1C。


3.根据权利要求1所述的一种己烯雌酚单克隆抗体及酶联免疫试剂盒的制备方法，其特征在于，所述载体蛋白可以为牛血清白蛋白（BSA）；所述包被原的制备方法如下：
称取7.0mg己烯雌酚半抗原DES-1C、13.0mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、8.0mgN-羟基琥珀酰亚胺（NHS）依次溶于0.6mlDMSO，加入0.5ml2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）缓冲液，室温搅拌活化5h，得到溶液1；取2ml浓度为5mg/ml的牛血清白蛋白（BSA）用1mlPBS稀释得到溶液2；将溶液1慢慢加入到溶液2，边加边搅拌，室温下搅拌3h；
将反应液装入透析袋，用0.01M的PBS透析纯化72h，每8h更换DES-1C-BSA透析液，除去未反应的小分子物质，取出透析袋内DES-1C-BSA透析液冷冻干燥，-20℃保存，作为包被原。


4.根据权利要求1所述的一种己烯雌酚单克隆抗体及酶联免疫试剂盒的制备方法，其特征在于，所述己烯雌酚杂交瘤细胞株的制备方法如下：将己烯雌酚半...

【专利技术属性】
技术研发人员：冒玉娟，王婧，陈晓兰，王帅兵，吴萌，王莹，赵丽，
申请(专利权)人：江苏农牧科技职业学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32