一种VEFG受体酶联诊断试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种检测人血管内皮生长因子(VEGF)的酶联检测试剂盒。试剂盒盒体内包括：VEGF受体包被的酶联反应板、辣根过氧化物酶(HRP)标记的单克隆抗体加保护剂配置的酶结合物、作为阳性对照的VEGF蛋白的冻干粉、作为阴性对照的蛋白冻干粉、样品稀释液、PBST浓缩洗液、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺配置的显色底物、作为终止液的2MH2S04、封板胶纸。本发明专利技术提供的试剂盒可用于癌症、血管病、糖尿病视网膜病及类风湿关节炎等有关与VEGF受体有关的疾病的诊断和预后，具有准确、特异、灵敏、稳定、方便等优点，因此具有十分广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药
，具体地说涉及一种检测人血管内皮细胞生长因子(VEGF)的酶联检测试剂盒及其制备方法。
技术介绍
肿瘤的发展和转移是多阶段的、复杂的、具有高度选择性的过程，涉及肿瘤细胞与宿主之间错综复杂的关系，其机理尚不甚清楚。近年来关于新的血管生成与肿瘤发展、转移和预后关系的研究进展迅速，证明新的血管生成是肿瘤生成、转移和转移灶生长的必要条件，血管内皮细胞生长因子(VEGF)是调节新血管生成的最重要的细胞因子。研究表明血管 内皮细胞生长因子(VEGF)在血管系统的发育分化中具有不可替代的作用。VEGF是一个分子量为45KD的高度糖基化的碱性蛋白，有两个相同亚单位通过二硫键结合形成，等电点为8. 5，有很强的耐热和耐酸能力。人VEGF基因有5种不同的异构体，分别为 VEGF206、VEGF189、VEGF165、VEGF145, VEGF121。VEGF 高亲和力结合位点仅位于血管内皮细胞上昀3种VEGF受体，即VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3，这3种受体主要分布于血管内皮细胞表面，均是跨膜受体。研究表明，VEGF受体在体外与VEGF有高度的亲和力(Kendall et al.PNAS USA，1993,90:10705-9) JEGF是癌症生长、转移所必需的一种因子。目前研究表明，在人类各种恶性肿瘤(即癌症)疾病中，VEGF的分泌增加有着普遍性和广泛性。有大量文献报道，VEGF在正常人和癌症患者中的浓度明显不同，正常人中的VEGF浓度很低或检测不到，而在癌症患者中VEGF浓度很高。因此，检测人血液中的VEGF浓度，能够用于癌症的早期普查诊断。另一方面，VEGF在人体血液中的浓度随肿瘤的消长情况而变化。肿块大、生长快时，VEGF的血液浓度就高；而当肿瘤因化疗或手术“临床治愈”时，VEGF的血液浓度降低。故VEGF得检测可作为疗效观察和预后的指标。VEGF是恶性肿瘤诊断中的一个重要组成部分。另外，血液VEGF水平增高亦见于糖尿病、血管炎症性疾病、某些免疫性疾病和妊娠等。现有技术中关于VEGF的生物检测方法，存在灵敏度较低、稳定性不佳等问题。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术的目的是提供一种酶联免疫检测人血管内皮细胞生长因子(VEGF)的检测试剂盒。本专利技术提供的试剂盒结果准确稳定、特异性强、灵敏度高、使用方便、便于推广。本专利技术的另一目的是提供上述酶联检测试剂盒的生产制备及使用方法。为实现上述目的，本专利技术提供一种VEGF受体酶联诊断试剂盒，包括酶联板、阳性对照、阴性对照、样品稀释液、酶联物、浓缩洗涤液、显色剂A & B、终止液和封板胶纸；其中酶联板为血管内皮细胞生长因子(VEGF)受体包被的酶联反应板；酶联物为辣根过氧化物酶标记血管内皮生长因子单克隆抗体。作为进一步优选方案，所述阳性对照为血管内皮细胞生长因子蛋白冻干粉；所述阴性对照为动物血清冻干粉；所述样品稀释液为O. 05%吐温-20 80，1%牛血清白蛋白，IOmM乙二胺四乙酸二钠，O. 05%硫柳汞，O. 4M NaCl, ρΗ6· 5 ；所述浓缩洗涤液为137mM NaCl, 2. 7mM KCl，10mMNa2HP04, 2mMKH2P04,0. 05% 吐温20，Ph7. 4 所述显色剂A液为H2O2溶液，所述显色剂B液为3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺溶液；所述终止液为2MH2S04溶液。作为进一步优选方案，上述各物质的量以酶联板的孔数为标准。 作为进一步优选方案，所述酶联板为96孔。一种上述VEGF受体酶联检测试剂盒的制备和操作方法，主要步骤为(a)将血管内皮细胞生长因子受体包被于固体支持物酶联反应板上；(b)用封闭液封闭；(c)特生物标本加入到预包被的酶联反应板反应孔中，生物标本中的血管内皮细胞生长因子特异地与血管内皮细胞生长因子受体结合；(d)用血管内皮细胞生长因子单克隆抗体检测血管内皮细胞生长因子；(e)显色底物为3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺溶液。作为进一步优选方案，步骤a所述的血管内皮细胞生长因子受体用昆虫细胞表达。作为进一步优选方案，步骤c所述的生物标本为癌症、血管病、糖尿病视网膜病及类风湿关节炎生物个体的血清、血浆、脑脊液、唾液、组织提取液或尿液。作为进一步优选方案，步骤d所述的血管内皮细胞生长因子单克隆抗体是用血管内皮细胞生长因子免疫小鼠所得。作为进一步优选方案，步骤d所述的单克隆抗体用辣根过氧化物酶标记。本专利技术试剂盒的独特性在于，它使用VEGF受体包被酶联板，能够确保VEGF能被本试剂盒所检测，能对标本有准确的测定。本试剂盒检测生物标本中的VEGF，优选来自癌症、血管病病人或其他疾病病人的标本。本专利技术所述方法的成功开发对于VEGF受体相同的疾病的检测和预后有着重要的意义，同时该方法也为VEGF受体疾病的防治、早期筛查、诊断工作提供了准确、简便、有效的监测手段，具有广泛的应用范围和社会需求。总之，本专利技术积极适应了现代生物、预防保健、临床诊断等领域的工作需要和人性化服务的需要，因此其应用前景十分广阔。具体实施例方式以下结合具体实施例，进一步阐明本专利技术。应理解，下述实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。比例和百分比基于重量，除非特别说明。实施例IVEGF受体酶联诊断试剂盒的制备本专利技术的试剂盒举例可以是下列物质(I) VEGF受体包被酶联板；(2)阳性对照(VEGF蛋白冻干粉)I支；(3)阴性对照(动物血清冻干粉)I支；(4)样品稀释液0. 050r6吐温20，lor6牛血清白蛋白，IOmM乙二胺四乙酸二钠，O.050r6 硫柳汞，O. 4M NaCl，ρΗ6· 5，I 瓶，(5)酶联物辣根过氧化物酶标记血管内皮生长因子单克隆抗体，I瓶；(6)浓缩洗涤液为137mM NaCl，2. 7mM KCl，IOmM Na2HP04, 2rrrMKH2P04,0. 050r6吐温 20，Ph7. 4，1 瓶；(7)显色剂A液位Η。0。溶液，显色剂B液为3，37，5，5四甲基联苯胺溶液，各I瓶；(8)终止液为 2ΜΗ，s04，I 瓶； (9)封板胶纸2张。上述各种物质量均以酶联板为96孔(12条8孔或8条12孔)为例计算的，若酶联板的孔数多于或少于96孔，则各物质量也应相应或多或少。上述VEGF受体酶联诊断试剂盒的制备方法(I) VEGF基因和VEGF受体基因的克隆以人胎盘cDNA文库为模板进行聚合酶链式反应(PCR)。依据VEGF基因的报道序列设计引物，PCR反应祭件95°C变性40秒，52°C退火I分钟，72°C延伸2分钟，30个循环后72°C保温10分钟。反应体系ddH2020.0uLIOxBuffer2.5uLdNTP(lOmM)0.5uL3' primer (lOOng/uL)O.SuLS7 primer (lOOng/uL)O.SuLTaq _5U/uL)O.SuL模板 NDAO.SuL总体积25uL凝胶电泳回收PCR扩增的片段，克隆到载体PMT18-T中，转化大肠杆菌DH5a，提取重组质粒进行酶切鉴定。VEGF基因的重组质粒命名为bVT18-l，VEGF受体基因的重组质粒本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种VEGF受体酶联检测试剂盒，其特征在于，所述VEGF受体酶联诊断试剂盒包括：酶联板、阳性对照、阴性对照、样品稀释液、酶联物、浓缩洗涤液、显色剂A＆B、终止液和封板胶纸；其中：酶联板为血管内皮细胞生长因子(VEGF)受体包被的酶联反应板；酶联物为辣根过氧化物酶标记血管内皮生长因子单克隆抗体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴克，
申请(专利权)人：吴克，
类型：发明
国别省市：