本发明专利技术属于分析测试技术领域，涉及一种快速筛选雌激素活性化合物的技术。其基本原理是将测试化合物、固定化１７β雌二醇与雌激素受体蛋白ＥＲα－ＬＢＤ或ＥＲβ－ＬＢＤ置于同一反应体系中，使测试化合物、固定化１７β雌二醇竞争性与ＥＲα－ＬＢＤ或ＥＲβ－ＬＢＤ结合，最后通过酶联反应检测结合在固定化１７β雌二醇上的雌激素受体蛋白数量。其基本雌激素活性评价依据是将测试化合物与１７β雌二醇对雌激素受体蛋白ＥＲα－ＬＢＤ或ＥＲβ－ＬＢＤ的竞争性结合能力相对比，从而对测试化合物的雌激素活性作出评价。本技术在环境污染物的毒理学研究、化合物代谢产物研究、工业品的毒性评价、药物筛选及有效成分分析等方面有广泛的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术专利属于分析测试
，涉及一种快速筛选雌激素活性化合物的技术。本技 术在环境污染物的毒理学研究、化合物代谢产物研究、工业品的毒性评价、药物筛选及有效 成分分析等方面有广泛的应用前景。
技术介绍
环境污染物对健康的影响是人们普遍关注的问题。近年来，越来越多的曾被认为"安全" 而广泛使用的化合物被证明具有雌激素或抗雌激素活性，能够引起一系列雌激素依赖的生理、 生化过程紊乱，导致实验或野生动物的胚胎发育异常、生殖能力下降、性别分化异常等现象。 虽然这些化合物对生物体的作用途径、生物效应各不相同，但一般都需要与雌激素受体发生 相互作用。在生物体内，雌激素与雌激素受体的相互作用机制一般为首先雌激素与雌激素受体结合，然后受体蛋白形成二聚体，最后此二聚体与目标基因上的雌激素响应元素(estrogen response element,ERE)结合，激活目标基因的表达，使细胞产生相应生理响应。从雌激素受 体蛋白的N端到C端包括6个不同的结构域，依次命名为A-F，结构域E有配体结合功能，称为 配体结合区(ligand binding domain, LBD)。为研究方便，通常用异源表达的LBD蛋白研究配 体与受体的相互作用。生物体内主要有两种不同的雌激素受体蛋白，分别称为ERa和ER(3。 不同组织中ERa和ER(3的比例不同，对配体的亲和活性及转录活性也不相同。由于雌激素活性化合物一般环境剂量低且作用机制复杂，其对生物体的影响难以用传统 的物理化学测试结果进行准确评估。为此，开发基于雌激素受体——配体相互作用的雌激素 活性化合物快速筛选技术具有重要意义。虽然，已有利用雌激素受体研究化合物的雌激素活 性的报道，但绝大多数报道中均采用氚标记的雌二醇作为竞争配体，通过其与雌激素受体结 合后放射性活度的变化来评价化合物与雌激素受体的结合活性。这种方法虽然准确度高，但 是由于试剂昂贵，且需要进行放射性操作，所以一般实验室难以进行。目前，与本专利技术相似 的竞争性酶联受体亲和反应筛选雌激素活性化合物技术未见报道
技术实现思路
本专利技术专利是一种基于雌激素受体——配体相互作用的竞争性雌激素活性化合物快速筛 选技术。其基本原理是将测试化合物、固定化17p雌二醇与雌激素受体蛋白ERa-LBD或 ER(3-LBD置于同一反应体系中，使测试化合物、固定化17(3雌二醇竞争性与ERa-LBD或 ER(3-LBD结合，最后通过酶联反应检测结合在固定化17P雌二醇上的雌激素受体蛋白数量对 测试化合物的雌激素活性作出评价。本专利技术专利是通过下述技术方案而实现的。1、 雌激素受体蛋白ERa-LBD或ER(3-LBD的制备。将ERa-LBD或ER(3-LBD质粒(100|iL) 转移到含感受态细胞(10(VL,溶于0.1mol/L的CaCl2)的离心管中，冰浴30分钟，于42'C水浴 放置90秒，再入冰浴，加入LB液体培养基500(iL，混匀后振荡培养(100rpm,37。C) 45min， 最后将上述菌液涂固体LB平板，37'C过夜。将ERa-LBD或ERP-LBD质粒转化的宿主菌接种 于含Amp十(100pg/mLl)的液体LB培养基(5 mL)，过夜培养(37°C， 200转)。过夜培养物 按4%接种比接种到含八11^+ (100pg/mL) 5ml液体LB培养基，通气培养(37°C， 200转)，直 到在600nm下，OD为0.5-0.7时加入IPTG，工作浓度为0.2mmol/L，温度25。C，振荡培养时间 为8小时，室温离心(10000rpm,10min)弃上清。把沉淀重悬于结合缓冲液中(0,5MNaCl， 20 mM Tris-HCl, 5 mM B引唑，pH7.9，每IOO mL培养基10 mL缓冲液)，加入蛋白酶抑制剂，用 超声波破碎仪破碎细胞(功率450W，工作时间3S，间隔时间3S，总时间6min)。将破碎液离 心后(12000rpm,20min)，依次用3倍体积去离子水，5倍体积NiS04 (0.05 M)， 3倍体积结合缓 冲液平衡His-Bind亲和萃取小柱。使上清液以IO mL/h速度流过亲和萃取柱。先用10倍体积结 合缓冲液冲洗萃取柱，然后用6倍体积洗涤液(0.5MNaCl,20mMTris-HCl,60mM吲唑，pH 7.9)冲洗。用6倍体积洗脱液(0.5MNaCl,20mMTris-HCl, 1 M d引唑，pH7.9)洗脱，收集洗 脱液，用Tris-HCl (20mM，pH7.5)透析后，用超滤离心管浓缩至20(^1，加入蛋白酶抑制剂， -80"保存。2、 雌激素受体蛋白ERa-LBD或ER(3-LBD多克隆抗体的制备。用上述经大肠杆菌异源表达 及纯化的ERa-LBD或ERP-LBD蛋白免疫动物制备多克隆抗体，具体歩骤如下取两只健壮的 青蓝紫兔，平均体重1.5kg，驯养2周后，注射卡介苗致敏，用剂量约为0.5mg/kg体重的抗原 与弗氏完全佐剂以体积比l:l充分混合，形成稳定的油包水胶体。进行足底及背部多点注射。 四周后进行第一次加强免疫，加强免疫试剂为弗氏不完全佐剂与抗原等体积混合液。此后， 每隔7天加强免疫一次，每次加强免疫前，取兔耳缘静脉血用双相免疫扩散方法测定抗体效价。 当抗体的效价达到满意的结果时，将兔子麻醉，进行颈动脉放血。收集的血液室温放置l小时， 然后4。C冰箱过夜放置，使血清析出。析出的血清在1500卬m离心10min，使血清和血浆充分 分离。血清中加入NaN3 (NaN3最终浓度为0.02X)，分装，-20°(3保存。3、竞争性酶联受体亲和反应分析方法的建立。本方法所用缓冲液有包被液(0.05mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液)，洗涤及稀释液(0.01mol/L pH7.4磷酸盐-NaCl缓冲液内含0.05。/。Tween-20,简称PBST)，封闭液(取上述稀释液配制成含 P/。的牛血清清蛋白溶液，临用前配制)，底物显色液(准确称取20mg邻苯二胺溶于50ml pH5.0, 0.05mol/L的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液，临用前加入80^iLH202)，终止液(2mol/L&304溶液)。本方法的具体步骤如下(1) 用250ng/mL的E2-BSA包被酶标板，每孔加入150)jL，室温放置2h后转入4t:冰箱孵 育过夜。(2) 用PBST洗涤，每孔200(JL，洗涤5次，每次1分钟。(3) BSA封闭，取稀释液配制1%的牛血清清蛋白(BSA)溶液，每孔中加入200iJL，置 37'C恒温箱中60分钟。(4) 用PBST洗涤，毎孔200ijL，洗涤5次，每次1分钟。(5) 加入待测化合物溶液或np雌二醇标准溶液(0.5-250 ng/mL)，毎孔50mL。(6) 加入ERa-LBD或ERp-LBD蛋白(100ng/mL)，每孔50pL; 37。C温育l小时。(7) 用PBST洗涤，毎孔200ijL，洗涤5次，每次1分钟。(8) 力口ERa-LBD或ER卩-LBD蛋白抗体(稀释64000倍)，毎孔50ijL， 37。C温育l小时。(9) 用PBST洗涤，每孔200)JL，洗涤5次，每次1分钟。(10) 加二抗(辣根酶标记山羊抗兔IgG)，将二抗稀释5000倍，每孔加100lJL 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种竞争性酶联受体亲和反应筛选雌激素活性化合物技术。其特征是所述的受体蛋白为重组人雌激素受体配体结合区域蛋白，所述抗体为重组人雌激素受体配体结合区域蛋白的多克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：江桂斌，时国庆，周群芳，史建波，
申请(专利权)人：中国科学院生态环境研究中心，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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