本发明专利技术公开了检测食品中土霉素残留的间接竞争酶联适配体分析方法（ELAA），属于食品安全分析领域。利用人工合成的土霉素适配体代替抗体，建立了土霉素的间接竞争ELAA方法。标准曲线的线性范围为0.5-50ng/mL，半数抑制量(IC50)为6.30ng/mL，灵敏度（IC90）0.5ng/mL。以禽肉、水产品、牛奶、奶粉和蜂蜜基质添加不同浓度的土霉素后，用ELAA方法测定，加标回收率为62.1%-102%，变异系数（CV）<20%。本发明专利技术建立的方法不仅具有ELISA的操作简单、检测快速、分析容量大等优点；而且又克服了抗体制备过程繁琐、周期长、费用高的问题；适用于大批量样本检测和现场监测，具有重要的实际应用意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测食品中土霉素残留的酶联适配体分析方法（ELAA)，属于食品 安全分析
。
技术介绍
土霉素（Oxytetracycline，0TC)，别名5-羟基四环素，地霉素，地灵霉素，氧四环 素等，是一种广谱抗菌药物，常作为牛、猪、家禽、鱼等动物疾病的预防和感染的治疗用药， 且由于其广谱抗菌活性和低费用常被用作畜禽的抗菌促生长添加剂。但目前一些养殖者盲 目追求利益，不遵守休药期规定，造成畜禽和水产品中土霉素残留严重，经过食物链被人体 吸收后，可导致骨骼缺钙和造成肝损害，最明显的残留毒性是诱导耐药菌株。另外，土霉素 在畜禽体内60%_90%以药物原形或初级代谢产物的形式随粪尿等排泄物进入环境，给对地 表水、农田土壤甚至地下水造成污染，这将导致对人类公共健康产生严重威胁。许多国家对 抗生素残留实行监控，世界粮农组织、世界卫生组织、欧盟及我国政府规定土霉素的残留限 量不得高于l〇〇mg/kg。因此，加快对土霉素残留的检测的探究，建立高灵敏、准确、快速的检 测方法，对保障我国食品安全和消费者健康具有重要意义。 目前，检测土霉素（Tetracyclines)的方法主要有高效液相色谱法（HPLC)、毛细 管电泳技术（CE)、液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS)、薄层色谱法（TCL)流动注射电化学发 光法、酶联免疫吸附法（ELISA)、胶体金免疫层析分析法（GICA)等。仪器分析方法虽然灵 敏度高、结果准确可靠等优点，但设备昂贵、操作复杂，检测时间长，不能满足大批量样品筛 选和现场快速检测的需要。快速检测方法通常采用抗原抗体特异相互作用识别模式，其中 以ELISA和GICA方法应用最多。但由于受到抗体易失活、制备依赖免疫动物和细胞、且繁 琐费时、一些小分子物质难以产生特异性抗体等因素的影响，在一定程度上限制了抗体在 快速检测技术的应用。 核酸适配体(Aptamer)技术的出现弥补了抗体在相关检测领域中应用的不 足。Aptamer作为一种新型的识别分子，是采用指数富集配体系统进化技术（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)从随机单链寡核苷酸库中筛 选出的能与靶物质高特异性、高亲和力结合的配体。其空间结构的多样性几乎可以与所有 种类的靶分子(细胞因子、蛋白、生物毒素、金属离子、小分子物质、细胞、微生物等）发生结 合。与传统的抗体相比，具有适应范围广；高亲和力和特异性，不受免疫条件和免疫原性限 制；制备简单，可体外人工合成；变性与复性可逆，性质稳定；易于标记，可反复使用和长期 保存等优点。显然，适配体的这些特点对于发展高灵敏、高选择性、快速高通量的靶标分子 检测十分重要，并日渐成为分析化学领域研究和应用的焦点。 目前已有关于酶联适配体检测土霉素相关文献的报道，如刘宾（暨南大学硕士论 文）建立了基于配适体的生物素-亲和素酶联检测土霉素的分析方法，但检测限低（I. 5g/ L)，高于世界粮农组织、世界卫生组织、欧盟及我国政府对食品中土霉素残留限量的规定 (100 mg/L)，不能满足对土霉素检测的需要。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足而提供一种检测食品中土霉素含量的酶联 适配体分析方法，其特点是以适配体代替传统抗体，基于抗原和适配体特异性结合而建立 的分析方法。该方法不需要制备抗体，操作简便，灵敏度高，特异性强，能够批量、快速检测 食品中土霉素的残留。 本专利技术所提供的食品中土霉素残留酶联适配体（ELAA)检测方法，通过以下步骤实 现。 I. BSA-土霉素包被原的制备：采用文献（21^叩￥，1^5，1^111，6七&1.工 Agric. Food Chem. 2007，55，211-218)报道的邻联甲苯胺法将土霉素标准品通过同型 双功能团试剂（〇-tolidine)与牛血清白蛋白（BSA)偶联得到包被原。将BSA或0VA、0TC和 偶联产物，于波长190?600nm下进行扫描鉴定。 2.间接竞争性ELAA方法。 (1)包被抗原：每孔加IOOu L 1600X稀释的包被抗原0TC-BSA，4°C孵育过夜， PBST缓冲液洗涤液3?5次，拍干。 (2)封闭：每孔加入200 L的封闭液，37°C孵育2h，PBST洗涤后烘干备用。 (3)加样：每孔依次加入50 ii L待测样品或稀释好的标品溶液，然后加入50 ii L 2nmol/L的适配体，37°C孵育lh，后洗涤液洗涤3?5次，拍干。 (4)酶标亲和素：每孔加入IOOii L 4000X稀释的酶标亲和素（Avidin/HRP)， 37°C孵育lh，后洗涤液洗涤3?5次，拍干。 (5)显色反应：每孔加入IOOiiL TMB底物显色液，37°C避光反应15min。 (6)终止：每孔加入100 ii L终止液终止反应，酶标仪450nm测吸光值。 3.标准曲线的绘制。 以不同土霉素浓度的对数为横坐标，以抑制率为纵坐标作图，绘制标准曲线。 Btl :标准浓度为Ong/mL所对应的吸光度；B :其它标准浓度所对应的吸光度。 4.样品制备。 (1)溶液配制。 三氯乙酸溶液（I. 25g/L):取三氯乙酸I. 25g，加超纯水溶解并稀释至1000mL。 0? 05% Tween-20 :取 Tween-20 0? 5mL，加超纯水稀释至 1000mL。 甲醇：分析纯。 提取液：将三氯乙酸溶液（I. 25g/L)、0? 05%Tween-20和甲醇以4:1:1体积比混合， 添加0. 05%巯基乙醇，使用前用超纯水稀释一倍。 PBS 缓冲液：2. 9g Na2HPO4 ? 12H20,0? 25g KH2PO4 ? 2H20,8g NaCl，0? 2g KCl，超纯水 定容至 lOOOmL，调 pH=7. 4。 ( 2 )组织样品前处理方法。 称取Ig组织样品于50mL离心管中，加入4mL提取液，润旋lOmin，15000r/min离 心10min。取上清液50uL，加入450 ii L PBS缓冲液（pH 7. 4)，涡旋混匀，取IOOii L用于ELAA 分析。 ( 3 )牛奶前处理方法。 量取牛奶样品5. OmL,加提取液5. OmL,润旋lOmin，15000r/min离心lOmin。弃去 脂肪层，吸取清液50 ii L加入950 ii L PBS缓冲液，涡旋混匀，取100 ii L用于ELAA分析。 (4)奶粉前处理方法。 称取Ig奶粉于50mL离心管中，加入IOmL提取液，润旋lOmin，15000r/min离心 lOmin。取上清液50 iiL，加入450 ii L PBS缓冲液（pH 7. 4)，涡旋混匀，取IOOii L用于ELAA 分析。 (5)蜂蜜前处理方法。 准确称取0? 5g蜂蜜样本于50mL旋盖离心管中，加入IOmL PBS缓冲液（pH 7. 4)， 润旋2min，超声5min，取上清液100 ii L用于ELAA分析。 与现有技术相比，本专利技术的有效效果：（1)不需要本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种间接竞争酶连适配体检测土霉素残留的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤:步骤一：土霉素包被原的制备；步骤二：建立测定土霉素的酶联适配体分析方法（ELAA）；步骤三：采用ELAA 对加标样品中土霉素含量的测定。
【技术特征摘要】
1. 一种间接竞争酶连适配体检测土霉素残留的方法，其特征在于，所述方法包括以 下步骤：步骤一：土霉素包被原的制备；步骤二：建立测定土霉素的酶联适配体分析方法 (ELAA);步骤三：采用ELAA对加标样品中土霉素含量的测定。2. 根据权利要求1所述的一种间接竞争酶连适配体检测土霉素残留的方法，其 特征在于：所述的包被原是采用邻联甲苯胺法将土霉素标准品通过同型双功能团试剂 (O-tolidine)与载体蛋白偶联获得的偶联物，其载体蛋白可以是BSA，也可以是OVA。3. 根据权利要求1所述的一种间接竞争酶连适配体检测土霉素残留的方法，其中 所述步骤二包括：（1).以碳酸盐缓冲溶液稀释包被抗原1 : 1600,加入酶标板中，每 孔100ii L，4°C孵育过夜，PBST缓冲液洗涤液3?5次，拍干；（2).每孔加入200ii L含 0. 1%BSA的上述碳酸盐缓冲液作为封闭液，37°C孵育2h，PBST洗涤后烘干备用；（3).用PBS 缓冲液将土霉素标准品稀释成〇, 〇. 5,1，2, 5,10, 50 ng/mL系列浓度，将上述稀释后的标准 品及处理好的样品，分别加入到各自的酶标孔中，加50 y L/孔；以适配体稀释液将生物素 标记的适配体稀释成2nmol/L，然后每孔加入50y L，37°C温育lh，然后以PBST洗涤液洗 涤3?5次，拍干；（4)将辣根过氧化物酶标记的亲和素（Avidin/HRP)用适配体稀释液以 1 : 4000进行稀释，然后每孔加入100iiL，37°C作用lh后以PBST洗涤液洗涤3?5次； 拍干；（5)每孔加入TMB显色液100iiL，37°C显色15min ;(6)加入终止液2mol/L硫酸溶 液，每孔100UL ;酶标仪450nm测吸光值，根据标准品制备的标准曲线对比计算出待测样 品的土霉素含量。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（3)中所述土霉素适配体的核苷酸序 为 5, -CGT ACG GAA TTC GCT AGC GGG CGG GGG TGC TGG GGG AAT GGA GT...
【专利技术属性】
技术研发人员：卢春霞，唐宗贵，罗小玲，刘长彬，康立超，李红敏，陈霞，王静，刘成江，李宇辉，侯小林，
申请(专利权)人：新疆农垦科学院，
类型：发明
国别省市：新疆;65
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