一种新型双功能抗体及其用途制造技术

本发明专利技术提供了一种抗体，包含了蛋白二聚体，所述蛋白二聚体包括：第一功能域，它包含免疫球蛋白链或特异性识别特定抗原的抗体结合位点；第二功能域，它包含免疫球蛋白链或特异性识别特定抗原的抗体结合位点，其特征在于：所述第一功能域由第一VH结构域和第一VL结构域组成，第二功能域由第二VH结构域组成。VH为重链可变区，VL为轻链可变区。本发明专利技术提供的双功能抗体，半衰期大大提高；且同源二聚体极少，即使出现聚集体，仅一次纯化就可鉴别和去除。

A new type of bifunctional antibody and its application

The invention provides an antibody, which comprises a protein dimer, the protein dimer comprises: a first functional domain, which comprises an immunoglobulin chain or an antibody binding site that specifically recognizes a specific antigen; a second functional domain, which comprises an immunoglobulin chain or an antibody binding site that specifically recognizes a specific antigen, which is characterized in that the first functional domain is composed of a first VH domain And the first VL domain, and the second VH domain. VH is heavy chain variable region, VL is light chain variable region. The half-life of the bifunctional antibody provided by the invention is greatly improved, and there are few homodimers, even if there are aggregates, they can be identified and removed only by one purification.

【技术实现步骤摘要】
一种新型双功能抗体及其用途
本专利技术涉及一种双功能抗体，具体涉及新型双功能抗体。
技术介绍
双特异性抗体(BsAb)又称双功能抗体，可同时识别和结合两种不同的抗原和表位，并阻断两种不同的信号通路以发挥其作用。根据不同结构可将双特异性抗体结构主要有2大类：含Fc片段的双特异性抗体(IgG-like双特异性抗体)与不含Fc片段的双特异性抗体(non-IgG-like双特异性抗体)。双特异性抗体的一个重要作用机制是介导免疫细胞杀伤，双特异性抗体有两条抗原结合臂，其中一条与靶抗原结合，另一条与效应细胞上的标记抗原结合，后者可以激活效应细胞，使其靶向杀伤肿瘤细胞。目前已经批准上市的2个双特异性抗体产品都属于这个类别，TrionPharma公司开发的catumaxomab能够靶向肿瘤表面抗原EpCAM和T细胞表面受体CD3，而Micromet公司和Amgen公司开发的Blinatumomab可以同时结合CD19和CD3。两者都是通过激活并召集杀伤性T细胞，从而达到治疗肿瘤的目的。但是blinatumomab抗体，已被证明只有几个小时很短的血液半衰期。但是目前已有的多种双功能抗体形式普遍面临易聚集、纯化产量低、稳定性差或血液半衰期短等问题。CN104829726A提供了一种双特异性CD19XCD3抗体，但是该抗体易于形成同源二聚体，难以鉴别、去除，极大增加了纯化和鉴定难度，使其工业化应用收到限制。肝细胞肝癌占原发性肝癌的70-90％，许多病人被确诊时已是晚期不能进行外科手术切除或射频消融等方法。目前临床被批准用于晚期HCC治疗的药物只有Sorafenib、Regorafenib和Lenvatinib多靶点激酶抑制剂，但仍对一些患者治疗有限，迫切需要新的治疗方式联合治疗。重新定向T细胞杀伤癌细胞的策略已被证明能够有效的治疗或辅助治疗癌症，如已经被FDA批准上市的CD3/CD19的双功能抗体Blinatumomab，用于治疗复发或难治性前体B细胞急性淋巴细胞白血病等。目前已有数十个靶向T细胞表面CD3分子来富集T细胞杀伤肿瘤细胞(实体瘤、血液瘤)的双功能抗体正在将进行临床实验。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)是一种硫酸乙酰肝素蛋白类聚糖，通过细胞顶膜上的糖基磷脂酰肌醇(Glycosyl-phosphatidylinositol,GPI)锚定连接于细胞表面。GPC3是近年发现的HCC细胞表面特异性膜蛋白，是良好的免疫治疗靶点，目前已有几个抗GPC3单克隆抗体，如hGC33(中外制药株式会社，专利号CN101186650A)和YP7(美国国立卫生研究院国家癌症研究所，专利号CN104520331)，被报道能诱发抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)抑制肝癌裸鼠移植的生长。将靶向GPC3的单克隆抗体与靶向T细胞表面CD3构建双功能抗体是治疗GPC3阳性肿瘤的重要方向。目前已有多种双功能抗体形式，但普遍面临易聚集、纯化产量低、稳定性差或血液半衰期短等问题。比如CN107556387A提供了一种链式抗-GPC3/CD3双特异性抗体，虽然能特异地识别并结合GPC3抗原和GPC3过表达的肿瘤细胞，介导T细胞发挥杀伤作用，但是该结构同blinatumomab抗体BITE结构类似，已被证明只有几个小时很短的血液半衰期。
技术实现思路
本专利技术解决了现有技术的上述技术问题。本专利技术提供了一种既能够保持双功能抗体功效，又易于鉴定、纯化和生产的双功能抗体。本专利技术的目的是通过以下措施实现的：一种抗体，包含了蛋白二聚体，所述蛋白二聚体：包括第一功能域，它包含免疫球蛋白链或特异性识别特定抗原的抗体结合位点；第二功能域，它包含免疫球蛋白链或特异性识别特定抗原的抗体结合位点，其特征在于：所述第一功能域由第一VH结构域和第一VL结构域组成，第二功能域由第二VH结构域组成。VH为重链可变区，VL为轻链可变区。为了进一步降低工业化生产的难度，如纯化、检测等，上述抗体还包括第三功能域，所述第三功能域包括第一Fc结构域和第二Fc结构域，第一Fc结构域与第一VL结构域相连，第二Fc结构域与第二VH结构域相连。上述抗体，第一功能域包含免疫球蛋白链或特异性识别CD3抗原的抗体结合位点；第二功能域包含免疫球蛋白链或特异性识别GPC3抗原的抗体结合位点。优选的，上述第一功能域包括CD3单克隆抗体的VH-VL功能域(ScFv)，通过铰链与第一人IgG1Fc功能域相连；上述第二功能域包括抗GPC3单克隆抗体的VH功能域，通过铰链与第二人IgG1Fc功能域相连。该结构结合GPC3抗原的抗体片段仅为ScFv的VH域，结合CD3抗原的抗体片段为ScFv域。上述第一功能域与第二功能域通过铰链区二硫键相连。优选的，对Fc片段改造进行了P329G/L234A/L235A定点突变，减弱Fc介导的ADCC作用和补体依赖的细胞毒性作用(CDC)。两个Fc片段还引入了knob-into-hole技术的点突变以进一步促进两个不对称异源二聚体的形成。氨基酸使用Eu编号。GPC3/CD3双功能抗体构型见图1。上述抗GPC3VH-Fc链的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。上述抗CD3VH-Fc链氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。一种核苷酸分子，包含SEQIDNO.2和SEQIDNO.4所示片段。分别可以用于编码GPC3VH-Fc链和CD3VH-Fc链。有益效果1.CN104829726B提供的双特异性CD19XCD3抗体，不好纯化与鉴定。即使Fc经过改造,利用了静电吸附等多种方式促使其异源二聚化，但仍易形成非目的二聚体，尤其是各自形成同源二聚体后难以鉴别与去除(图9)，使其工业化应用受到限制。而本专利技术提供的双功能抗体，经实验验证其同源二聚体极少，即使出现聚集体，仅一次纯化经过SDS-PAGE和SCEC_HPLC这些常规方法就可以鉴别是否发生聚集，并且能够有效的纯化、去除杂质。而且，本专利技术可以表达和生产更多的抗体量。2.本专利技术所述双功能抗体的半衰期大大提高，从常规的几个小时提高到十天左右。3.本专利技术经纯化的GPC3/CD3双功能抗体为单体，积分后纯度>99.9％，几乎无聚集体。阳性细胞株HepG2、Huh-7及人PBMCs与该双功能抗体具有较强的结合，但与GPC3阴性细胞株SK-Hep-1无结合。此种构型的双功能抗体仍保留与靶细胞较强的亲合力。4.本专利技术研究了新型结构的双功能抗体的生物物理特性及体内外生物活性。本专利技术所述双功能抗体，具有良好的热稳定。5.本专利技术所述双功能抗体，呈浓度依赖性的杀伤GPC3阳性细胞，在高E:T比例情况下对GPC3阴性细胞SK-Hep-1无杀伤作用。对HepG2具有较强的杀伤作用，此作用是通过激活初始T细胞分化为CD8+细胞毒性T细胞和CD4+辅助性T亚群。6.本专利技术所述双功能抗体在0.4mg/kg就能明显抑制小鼠肝癌移植瘤的生长，证明该抗体能够在体内有效发挥生物功能。附图说明图1GPC3/C本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗体，包含了蛋白二聚体，所述蛋白二聚体包括：第一功能域，它包含免疫球蛋白链或特异性识别特定抗原的抗体结合位点；第二功能域，它包含免疫球蛋白链或特异性识别特定抗原的抗体结合位点，其特征在于：所述第一功能域由第一VH结构域和第一VL结构域组成，第二功能域由第二VH结构域组成；VH为重链可变区，VL为轻链可变区。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗体，包含了蛋白二聚体，所述蛋白二聚体包括：第一功能域，它包含免疫球蛋白链或特异性识别特定抗原的抗体结合位点；第二功能域，它包含免疫球蛋白链或特异性识别特定抗原的抗体结合位点，其特征在于：所述第一功能域由第一VH结构域和第一VL结构域组成，第二功能域由第二VH结构域组成；VH为重链可变区，VL为轻链可变区。


2.如权利要求1所述的抗体，还包括第三功能域，所述第三功能域包括第一Fc结构域和第二Fc结构域，第一Fc结构域与第一VL结构域相连，第二Fc结构域与第二VH结构域相连。


3.如权利要求1或2所述抗体，第一功能域包含免疫球蛋白链或特异性识别CD3抗原的抗体结合位点；第二功能域包含免疫球蛋白链或特异性识别GPC3抗原的抗体...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛良鹏，余琳，邹贤刚，
申请(专利权)人：重庆市畜牧科学院，重庆金迈博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆;50