肺炎支原体IgM抗体的阳性血清替代品及其制备方法技术

本发明专利技术提供了肺炎支原体IgM抗体的阳性血清替代品，其特征在于：包括兔抗肺炎支原体IgM抗体和正常人免疫球蛋白M，兔抗肺炎支原体IgM抗体与正常人免疫球蛋白M通过交联反应，形成MP‑IgM抗体‑人IgM蛋白的交联物。如上所述的肺炎支原体IgM抗体的阳性血清替代品的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、制备兔抗肺炎支原体IgM抗体；S2、兔抗肺炎支原体IgM抗体与正常人免疫球蛋白M交联。由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明专利技术的优点是：既实现了与MP反应的IgM抗体性能，又实现了与人IgM抗体反应的抗原性能，关键是消除了人血清中可能存在的传染性致病因子的危险性。

A positive serum substitute for IgM antibody of Mycoplasma pneumoniae and its preparation

The invention provides a positive serum substitute for the IgM antibody of Mycoplasma pneumoniae, which is characterized in that it includes the Rabbit anti Mycoplasma pneumoniae IgM antibody and the normal human immunoglobulin M, the Rabbit anti Mycoplasma pneumoniae IgM antibody and the normal human immunoglobulin M form a cross-linked substance of MP \u2011 IgM antibody \u2011 human IgM protein through cross-linking reaction. The preparation method of the positive serum substitute for the IgM antibody of Mycoplasma pneumoniae as described above, which is characterized by the following steps: S1, preparation of the IgM antibody of rabbit against Mycoplasma pneumoniae; S2, cross-linking of the IgM antibody of rabbit against Mycoplasma pneumoniae and normal human immunoglobulin M. Compared with the prior art, the invention has the advantages of not only realizing the IgM antibody performance reacting with MP, but also realizing the antigen performance reacting with human IgM antibody. The key is to eliminate the risk of infectious pathogenic factors in human serum.

【技术实现步骤摘要】
肺炎支原体IgM抗体的阳性血清替代品及其制备方法
本专利技术涉及免疫学
具体地说，是涉及肺炎支原体IgM抗体的阳性血清替代品及其制备方法。
技术介绍
体外诊断试剂领域飞速发展，各方法学，各检测指标，日益丰富，给人类的临床指导提供了方便、快捷、准确的诊断方向。随着肺炎支原体IgM抗体的大规模生产和应用，肺炎支原体IgM抗体阳性血清的质控，临床对照需求逐渐增大，但其潜在的感染风险，不容忽视。尽管目前使用的阳性血清，都有严格的灭活流程，和灭菌处理方式，但其可能存在的感染风险仍没有明确结论。此外，国家对人血清严格监管，购买或收集资质要求高，来源少，价格高，这给阳性血清的使用单位提高了门槛，增加了难度。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述传统技术的不足之处，提供一种高效价的肺炎支原体IgM抗体的阳性血清替代品及其制备方法，既实现了与MP反应的IgM抗体性能，又实现了与人IgM抗体反应的抗原性能，关键是消除了人血清中可能存在的传染性致病因子的危险性。本专利技术的目的是通过以下技术措施来达到的：肺炎支原体IgM抗体的阳性血清替代品，其特征在于：包括兔抗肺炎支原体IgM抗体和正常人免疫球蛋白M，兔抗肺炎支原体IgM抗体与正常人免疫球蛋白M通过交联反应，形成MP-IgM抗体-人IgM蛋白的交联物。如上所述的肺炎支原体IgM抗体的阳性血清替代品的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、制备兔抗肺炎支原体IgM抗体；S2、兔抗肺炎支原体IgM抗体与正常人免疫球蛋白M交联。作为一种改进：兔抗肺炎支原体IgM抗体的制备包括以下步骤：S11、免疫；第一天，弗氏完全佐剂0.8-1.2ml、肺炎支原体重组蛋白0.8-1.2mg，颈部、大腿内部、背部10点注射；第四天，弗氏不完全佐剂0.8-1.2ml、肺炎支原体重组蛋白0.8-1.2mg，颈部、大腿内部、背部10点注射；第七天，弗氏不完全佐剂0.8-1.2ml、肺炎支原体重组蛋白0.8-1.2mg，颈部、大腿内部、背部10点注射；第十天，弗氏不完全佐剂0.8-1.2ml、肺炎支原体重组蛋白0.8-1.2mg，颈部、大腿内部、背部10点注射；第十二天，取血，离心取上清检测抗血清效价，如达到要求，即可开始每4-6天取一次血清；0.45μm微孔滤膜过滤。作为一种改进：离心取上清检测抗血清效价，如达不到要求，则每3天加强免疫一次，2天后取血清检测，直至检测效价合格。作为一种改进：兔抗肺炎支原体IgM抗体的制备还包括以下步骤：S12、纯化；A1、取抗血清20体积份分别加入15-25体积份PBS缓冲液和8-12体积份饱和硫酸铵溶液，充分混匀；A2、7000-9000r/min离心18-22min，弃上清，除去白蛋白，沉淀为粗提的免疫球蛋白；A3、沉淀加15-25体积份PBS缓冲液，再加入饱和硫酸铵溶液8-12体积份，充分混匀；A4、7000-9000r/min离心18-22min，弃上清；A5、沉淀加8-12体积份PBS缓冲液，装入透析袋，放于PBS缓冲液中4℃透析24-48h，直至无SO42-或NH4+出现为止；A6、透析结束后，2500-3500r/min离心18-22min，上清用0.22μm微孔滤膜过滤，即为纯化的MP-IgM抗体。作为一种改进：还包括以下步骤：A7、取MP-IgM抗体样本稀释100倍，紫外可见分光光度计测定其在波长260nm、280nm处的吸光值，然后计算得蛋白浓度。作为一种改进：还包括以下步骤：A8、取MP-IgM抗体样本通过SDS-PAGE电泳，完成电泳测试纯度。作为一种改进：所述饱和硫酸铵溶液的配置包括以下步骤：称硫酸铵400-425克，用50-80℃的蒸馏水500mL溶解，浓氨水调pH至7.3-7.5。作为一种改进：兔抗肺炎支原体IgM抗体与正常人免疫球蛋白M交联包括以下步骤：S21、将2质量份人IgM溶于450000-500000体积份结合缓冲液MES中，充分溶解；S22、将10质量份EDC溶于800-1200体积份水中；S23、将步骤S21的产物加入步骤S22的产物中，向混合液中缓慢加入含1.8-2.2质量份兔抗MP-IgM抗体的180-200体积份结合缓冲液；S24、透析分离产品，即得兔抗MP-IgM抗体与人免疫球蛋白M的交联产物。由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本专利技术的优点是：既实现了与MP反应的IgM抗体性能，又实现了与人IgM抗体反应的抗原性能，关键是消除了人血清中可能存在的传染性致病因子的危险性。下面具体实施方式对本专利技术作进一步说明。具体实施方式实施例1：肺炎支原体IgM抗体的阳性血清替代品，包括兔抗肺炎支原体IgM抗体和正常人免疫球蛋白M，兔抗肺炎支原体IgM抗体与正常人免疫球蛋白M通过交联反应，形成MP-IgM抗体-人IgM蛋白的交联物。实施例2：如实施例1所述的肺炎支原体IgM抗体的阳性血清替代品的制备方法，包括以下步骤：S1、制备兔抗肺炎支原体IgM抗体。选优的，兔抗肺炎支原体IgM抗体的制备包括以下步骤：S11、免疫。第一天，弗氏完全佐剂0.8ml、肺炎支原体重组蛋白0.8mg，颈部、大腿内部、背部10点注射；第四天，弗氏不完全佐剂0.8ml、肺炎支原体重组蛋白0.8mg，颈部、大腿内部、背部10点注射；第七天，弗氏不完全佐剂0.8ml、肺炎支原体重组蛋白0.8mg，颈部、大腿内部、背部10点注射；第十天，弗氏不完全佐剂0.8ml、肺炎支原体重组蛋白0.8mg，颈部、大腿内部、背部10点注射；第十二天，取血10ml，3500r/min，离心12min取上清检测抗血清效价，如达到要求（1:2000以上），即可开始每4天取一次血清。0.45μm微孔滤膜过滤，过滤分装至无菌管中，-20℃保存。如达不到要求，则每3天加强免疫一次，2天后取血清检测，直至检测效价合格。S12、纯化。A1、取抗血清20体积份分别加入15体积份PBS缓冲液和8体积份饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，充分混匀，静置30min。所述饱和硫酸铵溶液的配置包括以下步骤：称硫酸铵400克，用50℃的蒸馏水500mL溶解，浓氨水调pH至7.3。A2、7000r/min离心18min，弃上清，除去白蛋白，沉淀为粗提的免疫球蛋白。A3、沉淀加15体积份PBS缓冲液，使其完全溶解，再加入饱和硫酸铵溶液8体积份，充分混匀，4℃静置30min；。A4、7000r/min离心18min，弃上清。重复步骤A3、A4，2次。A5、沉淀加8体积份PBS缓冲液，完全溶解后，装入透析袋，透析除盐，放于PBS缓冲液中4℃透析24h，换液5次，以1%BaCl2检查透析液中的SO4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.肺炎支原体IgM抗体的阳性血清替代品，其特征在于：包括兔抗肺炎支原体IgM抗体和正常人免疫球蛋白M，兔抗肺炎支原体IgM抗体与正常人免疫球蛋白M通过交联反应，形成MP-IgM抗体-人IgM蛋白的交联物。/n

【技术特征摘要】
1.肺炎支原体IgM抗体的阳性血清替代品，其特征在于：包括兔抗肺炎支原体IgM抗体和正常人免疫球蛋白M，兔抗肺炎支原体IgM抗体与正常人免疫球蛋白M通过交联反应，形成MP-IgM抗体-人IgM蛋白的交联物。


2.如权利要求1所述的肺炎支原体IgM抗体的阳性血清替代品的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、制备兔抗肺炎支原体IgM抗体；
S2、兔抗肺炎支原体IgM抗体与正常人免疫球蛋白M交联。


3.根据权利要求2所述的肺炎支原体IgM抗体的阳性血清替代品的制备方法，其特征在于：兔抗肺炎支原体IgM抗体的制备包括以下步骤：
S11、免疫；
第一天，弗氏完全佐剂0.8-1.2ml、肺炎支原体重组蛋白0.8-1.2mg，颈部、大腿内部、背部10点注射；
第四天，弗氏不完全佐剂0.8-1.2ml、肺炎支原体重组蛋白0.8-1.2mg，颈部、大腿内部、背部10点注射；
第七天，弗氏不完全佐剂0.8-1.2ml、肺炎支原体重组蛋白0.8-1.2mg，颈部、大腿内部、背部10点注射；
第十天，弗氏不完全佐剂0.8-1.2ml、肺炎支原体重组蛋白0.8-1.2mg，颈部、大腿内部、背部10点注射；
第十二天，取血，离心取上清检测抗血清效价，如达到要求，即可开始每4-6天取一次血清；
0.45μm微孔滤膜过滤。


4.根据权利要求3所述的肺炎支原体IgM抗体的阳性血清替代品的制备方法，其特征在于：离心取上清检测抗血清效价，如达不到要求，则每3天加强免疫一次，2天后取血清检测，直至检测效价合格。


5.根据权利要求2所述的肺炎支原体IgM抗体的阳性血清替代品的制备方法，其特征在于：兔抗肺炎支原体IgM抗体的制备还包括以下步骤：
S12、纯化；
A1、取抗血清20体积份分别加入15-25体积份PBS缓冲液和8-12体积份饱和硫酸铵溶液，充分混匀；
A2、7000-9000r/min离心18-22m...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨帆，孙路璐，陈利军，王婷，王明儒，
申请(专利权)人：山东硕景生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37