抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株、抗人乙肝表面抗原单克隆抗体的制备方法技术

本发明专利技术涉及涉及生物工程技术领域，具体的说，涉及一种抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株、抗人乙肝表面抗原单克隆抗体的制备方法，抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株包括抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株1和抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株2，抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株1和抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株2及其传代细胞株分别能够稳定的分泌抗人乙肝表面抗原单克隆抗体1和抗人乙肝表面抗原单克隆抗体2，将上述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体分别纯化处理后，可以有效除去杂质，得到特异性强、纯度高、效价高、稳定性好、均一性好、重复性强的单克隆抗体。重复性强的单克隆抗体。重复性强的单克隆抗体。

【技术实现步骤摘要】
抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株、抗人乙肝表面抗原单克隆抗体的制备方法


[0001]本专利技术涉及生物工程
，具体的说，涉及一种抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株、抗人乙肝表面抗原单克隆抗体的制备方法。

技术介绍

[0002]乙肝表面抗原（HBsAg）是乙肝病毒的外壳蛋白，作为一种乙型肝炎病毒S基因的表达，其属于病毒包膜蛋白质的范畴，虽然其本身不具有传染性，但是在后期的疾病干预中，其属于最先出现的血清病毒抗原，基本结构和HBV模板息息相关，其与DNA水平存在较大的相关性，所以对关于HBsAg研究的价值进行分析。
[0003]HBsAg本身不具有传染性，但它的出现常伴随乙肝病毒的存在，所以它是已感染乙肝病毒的标志。乙肝表面抗原检查用于判断是否感染了乙肝病毒。它可存在于患者的血液、唾液、乳汁、汗液、泪水、鼻咽分泌物、精液及阴道分泌物中。HBsAg阳性只能说明这个人感染了HBV，但是不能确定这个人有没有传染性。如果需要确定患者体内的乙肝病毒是否具有传染性，还要检测其他项目。乙肝病毒的表现型是其血清亚型，由外膜主蛋白上的一些残基决定。
[0004]我国最常使用的测定乙肝表面抗原的方法是酶联免疫吸附试验法（ELISA）、胶体金层析法（GIA）。ELISA灵敏度高，特异性强，重复性好，可定量和半定量，但操作步骤相对复杂，需要特殊设备，不适用于急诊和血筛。GIA操作简单、方便、快速，可单人份检测，不需要特殊设备，但受限于方法学，准确性不如ELISA。
[0005]人乙肝表面抗原检测试剂，应用的主要生物原料为一对HBsAg单克隆抗体，HBsAg单克隆抗体性能的优劣对人乙肝表面抗原检测试剂的准确性、灵敏度、特异性有至关重要的作用。
[0006]抗人乙肝表面抗原单克隆抗体的制备主要有小鼠体内诱生腹水、杂交瘤细胞体外培养及基因工程等方法。其中由于小鼠体内诱生腹水制备方法成本低、产量大、生产工艺相对简单，短期内能实现大量制备，因此被广泛应用。但此方法所得到的抗人乙肝表面抗原单克隆抗体中含有多种杂质，为了获得高效价、高纯度、高特异性的抗体，必须筛选适合的纯化方法对其进行分离纯化，以满足在工业、科学研究或医疗诊断等方面的应用。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株、抗人乙肝表面抗原单克隆抗体的制备方法，抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株1和抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株2及其传代细胞株分别能够稳定的分泌抗人乙肝表面抗原单克隆抗体1和抗人乙肝表面抗原单克隆抗体2，将上述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体分别经过饱和硫酸铵盐和蓝胶亲和层析处理，或protein
‑
G层析和离子交换层析法处理后，可以有效除去杂质，得到特异性强、纯度高、效价高、稳定性好、均一性好、重复性强的
单克隆抗体。
[0008]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法，抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株包括抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株1和抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株2，抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株1和抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株2的制备方法，包括如下步骤：（1）动物免疫取6周龄的雄性BALB/c小鼠3只，用人乙肝表面抗原天然蛋白作为免疫原进行免疫，对小鼠进行断尾采血，检测血清效价，达到10万以上，进行细胞融合；（2）细胞融合将小鼠处死，浸泡于体积浓度为75%酒精中5min，在无菌环境下摘取免疫小鼠的脾脏，研磨分散细胞，洗涤离心后获得B淋巴细胞，将B淋巴细胞和骨髓瘤细胞SP2/0按照细胞数量比5:1的比例进行混合、离心，用无血清DMEM培养基清洗细胞，确保混合细胞中无血清，离心后弃上清，在37℃水浴中，在50s内匀速缓慢加入质量浓度50%PEG溶液1mL，边滴加边混合，待其反应90s后，将40mL在37℃预温的无血清DMEM培养基缓慢加入，保证PEG彻底稀释而终止融合，1000rpm离心10min，弃去上清，用37℃预温的HAT培养基重悬细胞沉淀，充分混匀，将其置于96孔细胞培养板中，放入5%二氧化碳的培养箱进行培养；（3）杂交瘤细胞筛选和亚克隆融合后的第三天以及第八天，分别用HAT培养基更换96孔细胞培养板中1/2的培养液，第十天吸取细胞上清，即待检测细胞上清；用间接ELISA的方法对待检测细胞进行筛选，第一次筛选后，用HAT培养基全部换培养液，反复筛选三次，挑选三次结果均为强阳性的细胞进行亚克隆，一般经过2
‑
3次亚克隆，直至96孔板的阳性率达到100%，结束亚克隆，即得到两个抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株，分别为抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株1和抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株2。
[0009]作为一种优化方案，所述人乙肝表面抗原天然蛋白的制备方法包括如下步骤：（1）低浓度PEG沉淀：收集无症状人乙肝表面抗原携带者血清，用终浓度为5%的PEG6000沉淀除去大颗粒和脂蛋白，于4 ℃静置2h，4000rpm离心30分钟，弃去沉淀物，留上清液；（2）高浓度PEG沉淀：上清液用终浓度为10%的PEG6000沉淀，于4 ℃静置2h，4000rpm离心30分钟，弃去沉淀物，留上清液，得初纯人乙肝表面抗原天然蛋白；（3）制备免疫亲合层析柱；（4）人乙肝表面抗原的亲和层析纯化，包括如下步骤：将步骤（3）制备好的免疫亲合层析柱连接于电脑紫外检测仪，免疫亲合层析柱纯化时，用于监测纯化过程中样本OD280的实时变化，根据OD280监测结果，收集纯化后的有效样本；
ꢀ①
平衡：用结合液清洗免疫亲合层析柱直至电脑紫外检测仪OD280检测的第一峰回到基线，即达到平衡，结合液为10mM PBS、150mM NaCl；
ꢀ②
上样：将步骤（2）得到的初纯人乙肝表面抗原天然蛋白上平衡后的免疫亲和层析柱，收集流出液，至电脑紫外检测仪OD280检测的基线稳定；
ꢀ③
洗脱：加入洗脱液，洗脱液为pH 3.0的甘氨酸
‑
盐酸溶液，待电脑紫外检测仪OD280检测的基线上升时开始收集，至电脑紫外检测仪OD280检测的基线下降并稳定，所收集的洗脱液用中和液调pH至7.4，经Sephadex G25柱脱盐，即得人乙肝表面抗原天然蛋白，
‑
20℃分装保存，中和液为1M pH 8.5 Tris
‑
HCl。
[0010]作为一种优化方案，所述免疫亲合层析柱的制备方法包括如下步骤：
①
偶联：取外购的成品介质
‑
溴化氰预活化的琼脂糖凝胶放于砂芯漏斗中，用预冷的偶联溶液A 0
‑
4℃洗涤，至少洗涤30min； 偶联溶液A为1mM HCl；
②
配基：取外购的抗人乙肝表面抗原单克隆抗体置于偶联溶液B中洗涤，抗人乙肝表面抗原单克隆抗体偶联浓度为5
‑
10mg/mL填料；偶联溶液B为0.1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于：抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株包括抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株1和抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株2，抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株1和抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株2的制备方法，包括如下步骤：（1）动物免疫取6周龄的雄性BALB/c小鼠3只，用人乙肝表面抗原天然蛋白作为免疫原进行免疫，对小鼠进行断尾采血，检测血清效价，达到10万以上，进行细胞融合；（2）细胞融合将小鼠处死，浸泡于体积浓度为75%酒精中5min，在无菌环境下摘取免疫小鼠的脾脏，研磨分散细胞，洗涤离心后获得B淋巴细胞，将B淋巴细胞和骨髓瘤细胞SP2/0按照细胞数量比5:1的比例进行混合、离心，用无血清DMEM培养基清洗细胞，确保混合细胞中无血清，离心后弃上清，在37℃水浴中，在50s内匀速缓慢加入质量浓度50%PEG溶液1mL，边滴加边混合，待其反应90s后，将40mL在37℃预温的无血清DMEM培养基缓慢加入，保证PEG彻底稀释而终止融合，1000rpm离心10min，弃去上清，用37℃预温的HAT培养基重悬细胞沉淀，充分混匀，将其置于96孔细胞培养板中，放入5%二氧化碳的培养箱进行培养；（3）杂交瘤细胞筛选和亚克隆融合后的第三天以及第八天，分别用HAT培养基更换96孔细胞培养板中1/2的培养液，第十天吸取细胞上清，即待检测细胞上清；用间接ELISA的方法对待检测细胞进行筛选，第一次筛选后，用HAT培养基全部换培养液，反复筛选三次，挑选三次结果均为强阳性的细胞进行亚克隆，一般经过2
‑
3次亚克隆，直至96孔板的阳性率达到100%，结束亚克隆，即得到两个抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株，分别为抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株1和抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株2。2.根据权利要求1所述的抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于：所述人乙肝表面抗原天然蛋白的制备方法包括如下步骤：（1）低浓度PEG沉淀：收集无症状人乙肝表面抗原携带者血清，用终浓度为5%的PEG6000沉淀除去大颗粒和脂蛋白，于4 ℃静置2h，4000rpm离心30分钟，弃去沉淀物，留上清液；（2）高浓度PEG沉淀：上清液用终浓度为10%的PEG6000沉淀，于4 ℃静置2h，4000rpm离心30分钟，弃去沉淀物，留上清液，得初纯人乙肝表面抗原天然蛋白；（3）制备免疫亲合层析柱；（4）人乙肝表面抗原的亲和层析纯化，包括如下步骤：将步骤（3）制备好的免疫亲合层析柱连接于电脑紫外检测仪，免疫亲合层析柱纯化时，用于监测纯化过程中样本OD280的实时变化，根据OD280监测结果，收集纯化后的有效样本；
ꢀ①
平衡：用结合液清洗免疫亲合层析柱直至电脑紫外检测仪OD280检测的第一峰回到基线，即达到平衡，结合液为10mM PBS、150mM NaCl；
ꢀ②
上样：将步骤（2）得到的初纯人乙肝表面抗原天然蛋白上平衡后的免疫亲和层析柱，收集流出液，至电脑紫外检测仪OD280检测的基线稳定；
ꢀ③
洗脱：加入洗脱液，洗脱液为pH 3.0的甘氨酸
‑
盐酸溶液，待电脑紫外检测仪OD280检测的基线上升时开始收集，至电脑紫外检测仪OD280检测的基线下降并稳定，所收集的洗
脱液用中和液调pH至7.4，经Sephadex G25柱脱盐，即得人乙肝表面抗原天然蛋白，
‑
20℃分装保存，中和液为1M pH 8.5 Tris
‑
HCl。3.根据权利要求2所述的抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于：所述免疫亲合层析柱的制备方法包括如下步骤：
①
偶联：取外购的成品介质
‑
溴化氰预活化的琼脂糖凝胶放于砂芯漏斗中，用预冷的偶联溶液A 0
‑
4℃洗涤，至少洗涤30min； 偶联溶液A为1mM HCl；
②
配基：取外购的抗人乙肝表面抗原单克隆抗体置于偶联溶液B中洗涤，抗人乙肝表面抗原单克隆抗体偶联浓度为5
‑
10mg/mL填料；偶联溶液B为0.1M NaHCO3、0.5M NaCl，pH8.3；
③
将步骤
①
中洗涤好的介质用偶联溶液 A 稀释，并与
②
中洗涤好的抗人乙肝表面抗原单克隆抗体等体积混合，室温20
‑
25℃混匀2h或4℃混匀过夜，得凝胶；
④
对凝胶进行封闭和清洗：封闭：抽去偶联上清并加入封闭液，封闭液为0.1M Tris
‑
HCl，pH8.0，室温封闭2
‑
4h；清洗：用pH8
‑
9的0.1M Tris
‑
HCl和0.5M NaCl混合液与pH3
‑
4的0.1M醋酸盐缓冲液和0.5M NaCl混合液交替洗涤3
‑
6次，每次用5倍介质体积的液体洗涤，再用PBS缓冲液清洗后得免疫亲合层析柱。4.根据权利要求1所述的抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于：所述亚克隆的操作方法为：将筛选到的阳性孔，转移到新的96孔细胞培养板，采用倍比稀释法，进行亚克隆，七天后，将培养基换成含20v/v%FBS的DMEM完全培养基，继续培养；8
‑
12天后，用间接ELISA的方法检测培养上清，连续进行两次筛选及亚克隆，选取细胞团单一的阳性孔，继续亚克隆，同时将每次克隆化的剩余细胞扩大培养冻存。5.根据权利要求1所述的抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于：用间接ELISA的方法对待检测细胞进行筛选，具体方法如下：
①
包被：用包被液将乙肝表面抗原天然蛋白稀释成1μg/mL，100μL/孔包被到酶标板中，37℃2h或4℃包被过夜，用PBST缓冲液洗板5次，除去未结合的抗原及杂质，拍干酶标板；包被液为pH9.6的碳酸盐缓冲液；
②
封闭：每孔加入含1w/v%BSA的PBST缓冲液进行封闭，150μL/孔，37℃孵育2h，用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板；
③
加待检测细胞上清：将待检测细胞上清加入到酶标板中，100μL/孔，同时用小鼠免疫血清做阳性对照，用HAT培养基做空白对照，37℃水浴30min，用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板；
④
加酶标二抗：用PBS缓冲液将HRP标记的羊抗鼠抗体1000倍稀释，加入到酶标板中，50μL /孔，37℃水浴30min，用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板；
⑤
显色：加入TMB显色液显色，100μL/孔，37℃孵育10min；用2mol/L硫酸进行终止，50μL/孔，于酶标仪450nm波长下检测结果，检测样本OD值/阴性对照OD值≥2.1，即为阳性，完成一次筛选。6.根据权利要求1所述的抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于：用人乙肝表面抗原天然蛋白作为免疫原进行免疫的方法为：第一次免疫剂量为
80μg/只，一...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨帆，王婷，刘万建，张媛媛，张纯瑶，郭慧，孙玉可，
申请(专利权)人：山东硕景生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：