杂交瘤细胞对、单克隆抗体对及其在检测牛筋草EPSPS蛋白中的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体公开了杂交瘤细胞对、单克隆抗体对及其在检测牛筋草EPSPS蛋白中的应用。本发明专利技术的杂交瘤细胞对，其包括第一杂交瘤细胞株EP001

【技术实现步骤摘要】
杂交瘤细胞对、单克隆抗体对及其在检测牛筋草EPSPS蛋白中的应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体地说，涉及杂交瘤细胞对、单克隆抗体对及其在检测牛筋草EPSPS蛋白中的应用。

技术介绍

[0002]草甘磷是一种非选择性的广谱除草剂，具有高效、低毒、无残留等优点，尤其是对人畜毒害小，被广泛应用。EPSPS（5
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烯醇式丙酮酰莽草酸
‑3‑
磷酸合酶，5
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enolpyruvyl
‑
shikimate
‑3‑
phosphate synthase）是生物体内芳香族氨基酸—色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸生物合成过程中的关键酶，研究发现，草甘膦通过竞争性结合EPSPS，抑制了EPSPS的活性，从而阻断了芳香族氨基酸的合成，最终导致受试植物死亡。自然界中绝大部分植物体内EPSPS均属于草甘膦敏感型，因此草甘膦可作为理想的广谱型除草剂。同时，目前为了解决其同时非选择性地灭生农作物的问题，已有多种具有草甘膦抗性的转基因作物被成功商业化。
[0003]但是草甘膦的长期使用，会引起杂草（牛筋草）对草甘膦产生抗性，使得转基因作物减产。因此，若可有效判定杂草是否具有草甘膦抗性，则可更好地指导除草剂的使用。
[0004]经研究发现，杂草对草甘膦的靶标抗性机制分为靶标突变和靶标酶过量表达两种。目前，抗性的分子检测方法主要有：(1)EPSPS序列保守位点PCR检测；(2)EPSPS基因表达量qPCR检测；(3)EPSPS蛋白免疫印迹检测等，其中PCR与qPCR的方法对场地、仪器、技术人员的要求比较高，样本处理复杂，成本较高。蛋白免疫印迹检测方利用免疫学原理对目的蛋白进行定性定量鉴定，利用靶标蛋白抗体可以通过Western blot和ELISA方法进行定性定量分析，检测植株中目的蛋白在不同组织器官和不同环境条件下的表达水平。但Western Blot及ELISA法需要较繁琐的操作步骤及较长的孵育时间，检测结果需要仪器判读，并不适用于田间现场等应用环境下的快速检测使用。
[0005]胶体金试纸法将特异的抗体交联到试纸条上，利用胶体金试纸条技术制备的单克隆抗体试纸条，可以对目的蛋白进行快速的检测鉴定，该方法对场地、仪器、技术人员的要求相对较低，检测时间短，在现场快速检测及大规模筛查上具有理想的应用前景。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种可快速、高效、简便实现牛筋草EPSPS蛋白检测的新方法。
[0007]具体方案如下：本专利技术提供一组杂交瘤细胞对，其包括第一杂交瘤细胞株EP001
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1和第二杂交瘤细胞株EP001
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2；所述第一杂交瘤细胞株EP001
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1的保藏编号为CGMCC NO.45609；所述第二杂交瘤细胞株EP001
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2的保藏编号为CGMCC NO.45610。
[0008]本专利技术的第一杂交瘤细胞株EP001
‑
1和第二杂交瘤细胞株EP001
‑
2，已于2023年5
月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为BALB/c小鼠单克隆杂交瘤细胞，保藏编号分别为CGMCC No. 45609和CGMCC NO.45610。
[0009]本专利技术还提供一组单克隆抗体对，其包括第一单克隆抗体和第二单克隆抗体；所述第一单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No .45609的杂交瘤细胞株EP001
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1分泌产生，所述第二单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No .45610的杂交瘤细胞株EP001
‑
2分泌产生。
[0010]本专利技术将特定的杂交瘤细胞对生产的单克隆抗体对组合使用，可实现SEQ ID NO:1所示蛋白（牛筋草EPSPS蛋白）的胶体金法检测，可用于判断植物（如牛筋草）对除草剂草甘膦是否存在抗性，从而指导除草剂的使用。
[0011]进而，本专利技术提供上述杂交瘤细胞对或单克隆抗体对在检测含EPSPS蛋白的牛筋草上的应用，以及在制备检测SEQ ID NO:1所示蛋白（牛筋草EPSPS蛋白）的产品上的应用。
[0012]本专利技术的单克隆抗体对组合使用，对牛筋草EPSPS蛋白的检测灵敏度高，特异性强，可对牛筋草不同器官中的EPSPS蛋白进行快速检测。
[0013]本专利技术还提供一种检测牛筋草EPSPS蛋白的胶体金试纸，其T线上包被有第二单克隆抗体，C线包被有上抗鼠IgG二抗，金标垫上含有胶体金标记的第一单克隆抗体，所述第一单克隆抗体和第二单克隆抗体如上所述。
[0014]本专利技术的胶体金试纸，金标垫上，所述胶体金标记的第一单克隆抗体的浓度为0.2
‑
0.6 mg/mL，优选0.4 mg/mL，每条试纸上的包被量为0.24
‑
0.4 μg。
[0015]本专利技术的胶体金试纸，T线上包被的第二单克隆抗体的浓度为0.5
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1.5 mg/mL。优选，每条试纸上的包被量为0.15
‑
0.45 μg。也可以将单抗替换成多抗。
[0016]本专利技术的胶体金试纸，C线上包被的抗鼠IgG二抗的浓度为0.7
‑
1.2 mg/mL，优选1 mg/mL。
[0017]本专利技术的胶体金试纸具体可由样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和背板组成。
[0018]优选地，所述样品垫为玻璃纤维素膜。
[0019]硝酸纤维素膜可以替换成醋酸纤维素膜。
[0020]本专利技术另提供上述胶体金试纸在检测待检测样品中牛筋草EPSPS蛋白中的应用。
[0021]本专利技术的应用中，所述待检测样品为牛筋草叶片、牛筋草茎或牛筋草种子。
[0022]本专利技术检测牛筋草EPSPS蛋白的胶体金试纸的具体检测步骤及原理如下：先将试纸垂直插入检测样品中，样品溶液将沿样品垫渗透至胶体金标记抗体的试纸条，如果样品溶液中含有牛筋草蛋白EPSPS，那么EPSPS蛋白将与金标垫上的第一抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体结合，并与NC膜上的第二抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体结合，8
‑
10 min后，可观察到检测区的颜色变化，即出现阳性条带；如果样品溶液中不含牛筋草蛋白EPSPS，那么检测区则观察不到阳性条带。而无论样品溶液中是否含有牛筋草蛋白EPSPS，当样品溶液到达硝酸纤维素膜的质控线时，金标试纸条上的第一抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体均可与质控区包被的抗鼠IgG二抗结合，从而显色。
[0023]具体结果判断标准为：阴性结果（
‑
），只出现1条C线；阳性结果（+）：同时出现T线和C线。
[0024]本专利技术的检测牛筋草EPSPS蛋白的胶体金试纸，对叶片、种子和茎组织等复杂基质
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.杂交瘤细胞对，其特征在于，包括第一杂交瘤细胞株EP001
‑
1和第二杂交瘤细胞株EP001
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2；所述第一杂交瘤细胞株EP001
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1的保藏编号为CGMCC NO.45609；所述第二杂交瘤细胞株EP001
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2的保藏编号为CGMCC NO.45610。2.单克隆抗体对，其特征在于，包括第一单克隆抗体和第二单克隆抗体；所述第一单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No. 45609的杂交瘤细胞株EP001
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1分泌产生，所述第二单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No. 45610的杂交瘤细胞株EP001
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2分泌产生。3.权利要求1所述的杂交瘤细胞对或权利要求2所述的单克隆抗体对在检测含EPSPS蛋白的牛筋草上的应用。4.权利要求1所述的杂交瘤细胞对或权利要求2所述的单克隆抗体对在制备检测牛筋草EPSPS蛋白的产...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈景超，李香菊，崔海兰，于海燕，李志玲，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：