杂交瘤细胞株、抗芋螺毒素α-GI单克隆抗体及应用制造技术

本发明专利技术公开了杂交瘤细胞株、抗芋螺毒素α

【技术实现步骤摘要】
杂交瘤细胞株、抗芋螺毒素
α
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GI单克隆抗体及应用


[0001]本专利技术涉及抗芋螺毒素α
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GI单克隆抗体Anti
‑
GI
‑
444
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No.7重链和轻链可变区基因、所述基因编码的多肽，以及制备基因和多肽在芋螺毒素α
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GI染毒诊断和治疗中的应用。

技术介绍

[0002]芋螺是世界上最古老的生活在热带海洋中的肉食性软体生物物种之一，最早出现在5500万年前，属于腹足纲芋螺科(Conidae)，与锥螺科(Turridae)、笋螺科(Terebridae)同属于芋螺首科(Conoidea)，并且同以具有毒液装置为其特征，但以芋螺科生物毒性最大，种类最多。芋螺毒液中可能含50
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200个相对分子质量小的生物活性多肽，是发现的最小核酸编码的动物神经毒素肽，也是二硫键密度最高的小肽，能够相对特异性的阻断高等生物体内各种不同类型的离子通道和受体及其亚型,具有巨大的药物开发和利用价值。不同种属芋螺所分泌生物活性肽各不相同，即使同种芋螺因海域不同，其毒素成分也可存在差别，理论上估计有5万多种不同活性肽存在于芋螺毒液中。
[0003]芋螺毒素(Conotoxin,Conopeptide,CTx)是一大类由海洋芋螺的毒液管和毒囊内壁毒腺所分泌的一系列富含二硫键的生物活性肽，多数由10
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40个氨基酸残基组成，其能够特异性地靶向细胞膜上的不同离子通道受体，因而具有重要的药用潜力。不同化学结构的芋螺毒素，并不是随机性的化学产物，而是不断进化、优化而生成的高生物活性肽，且在毒理作用上具有密切的协同作用，如芋螺通过芋螺毒液中各种毒素的组合作用来实现对其他生物的捕食。例如，地纹芋螺毒液中既含有高强度的nAChR拮抗剂ω
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芋螺毒素，又含有Na
+
通道阻断剂μ
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芋螺毒素；前者作用类似于α
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银环蛇毒素，后者作用类似于河豚毒素(Tetrodotoxin，TTX)，在这两类芋螺毒素的共同作用下，导致神经肌肉传导完全阻断。
[0004]芋螺毒素家族成员有不同的分类方法。根据芋螺毒素基因及其前体蛋白信号肽的保守性，可将芋螺毒素分为A、M、O、T、P、I等20多个超家族。根据其药理学靶点的不同，芋螺毒素又可分为a、μ、w、κ、δ、σ、ρ、加压素、惊厥剂、睡眠肽等药理家族。其中，α、αA、κA属于A
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超家族，ω、δ、κ、μO属于O
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超家族，μ、ψ、KM属于M
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超家族。此外，根据芋螺毒素作用于生物体内的不同靶位可分为3类：(1)作用于电压门控离子通道(或称电压敏感性通道)的CTx，常以通透的离子Na
+
，K
+
，Ca
2+
等命名；(2)作用于配体门控离子通道(又称化学门控或递质依赖性通道)的CTx，包括烟碱受体、5
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HT3受体、NMDA受体，按相应的受体命名；(3)作用于G
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蛋白受体靶标的CTx，如：芋螺加压素和芋螺惰性素，以及2种磷脂(conodipineM和PLA2)，它们基本上不含有二硫键；按其作用的受体靶点可将芋螺毒素分为α、ω、μ、δ等多种亚型。
[0005]芋螺毒素家族成员中，研究较多的是A
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超家族芋螺毒素，包括α
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、αA
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和κA
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芋螺毒素，其通常由10
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30个氨基酸组成，富含两对或三对二硫键，且含有两对二硫键的α
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芋螺毒素均按照1
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3、2
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4配对方式形成loop框架。A
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超家族α
‑
芋螺毒素(α
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CTx)是发现最早、分布最广、丰度最高的一类CTx,通常含两个二硫键，是一些12
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30个氨基酸的小肽。有20种α
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CTx的一级结构得到了确证，分别来自不同的芋螺种属。一种芋螺同时可能含有6种以上的α
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CTx，其靶点均为烟碱型乙酰胆碱受体(Nicotinic Acetylcholine Receptors，nAChRs)。
nAChRs主要与人体中枢神经系统功能紊乱密切相关，如药物成瘾、疼痛、肿瘤发生等多种病理过程，也是临床上肌肉松弛药的主要药物靶点，因而α
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CTx是肌肉或神经型nAChRs的选择性阻断剂。此外，不同生物物种或同一种物种体内均存在多种nAChR受体亚型，某些生物体nAChR受体亚型可达16种之多。为了适应此种生态环境，α
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CTx的分子结构不断进化，其二硫键间的LOOPs环框架与氨基酸组成发生变异。单个氨基酸取代即可提高α
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CTx对某一nAChR受体亚型的选择性100倍以上。
[0006]α
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芋螺毒素GI(ECCNPACGRHYSC
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NH2)来自地纹芋螺(C.geographus)，属于α
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芋螺毒素，仅含13个氨基酸、2对二硫键。其作用靶标为nAChRs，是目前发现的毒性最强芋螺毒素，能导致中毒对象肌肉麻痹及呼吸抑制，小鼠腹腔注射的半数致死量(LD50)仅为8～12μg/kg。目前，尚无有效药物及抗体用于GI毒素中毒的急救和治疗策略。
[0007]α
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芋螺毒素GI的化学结构一般式如下式所示：
[0008][0009]芋螺毒素制备的方法主要有三种。第一种是自天然芋螺毒管中直接提取，此方法获取量非常少，且由于海洋生态环境的破坏使得野生芋螺数量急剧减少，且随着近年来海洋生态的破坏使野生芋螺数量急剧降低，该法会进一步加剧芋螺资源恶化，靠分离提取获得大量的芋螺毒素用于研究和生产并不现实。但提取到的少量天然毒液可通过一系列仪器分析手段得到单个毒素肽的氨基酸序列，再根据所得序列人工合成这些肽，可进一步用于活性测试和结构分析。第二种是基因工程方法，即将芋螺毒素的基因转化到微生物基因组中使其表达，后期再进行分离纯化。由于部分芋螺毒素的N端为Cys，酰胺化C端，加之原核表达系统无法加工去除N
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端信号肽序列，无法解决酰胺化C端问题；同时芋螺毒素分子小，碱性氨基酸较多，难于形成特定活性构象，使得分离纯化较为困难。但随着基因工程技术的日新月异，用芋螺毒素成熟肽基因，拼接原核或真核生物的信号肽，或同时转入酰胺化酶基因，可望生产出大量廉价的重组芋螺毒素。第三种方法采用人工化学合成的方法获取芋螺毒素，即通过分离天然芋螺毒素获取其氨基酸序列，目前使用较多的方法是多肽固相合成法。与传统的液相合成法相比，该方法具有很多优势，例如易清洗过滤容易将产物分离；可以将流程自动化；反应更彻底且过程损失小等。
[0010]作为识别抗原独特位点的特异性免疫球本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCC NO:C202339。2.一种抗芋螺毒素α
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GI单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌得到，能特异结合芋螺毒素α
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GI。3.一种抗芋螺毒素α
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GI单克隆抗体，其特征在于，所述的抗芋螺毒素α
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GI单克隆抗体的重链可变区的基因序列如SEQ ID NO:1所示；所述的抗芋螺毒素α
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GI单克隆抗体的轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO:2所示。4.一种抗芋螺毒素α
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GI单克隆抗体，其特征在于，所述的抗芋螺毒素α
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GI单克隆抗体的重链可变区基因编码的多肽产物，具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述的抗芋螺毒素α
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GI单克隆抗体的轻链可变区基因编码的多肽产物，具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。5.一种抗芋螺毒素α
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GI单克隆抗体，其特征在于，所述的抗芋螺毒素α
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GI单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列包含特定的抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，序列分别为SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7；轻链...

【专利技术属性】
技术研发人员：李玲，陈志南，杨向民，朱平，王彬，张坤，张雪芹，张征，段子川，
申请(专利权)人：中国人民解放军空军军医大学，
类型：发明
国别省市：