【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其涉及一种derf1重组抗原、其制备方法及应用。
技术介绍
1、粉尘螨是广泛存在于人类生活和工作环境中的一种重要过敏原，可引起过敏性哮喘、过敏性鼻炎、皮炎等多种过敏性疾病。目前在粉尘螨中发现具有致敏性的蛋白近40种，其中derf1、derf2、derf23等蛋白被列为粉尘螨主要致敏蛋白，其中derf1蛋白能与90%以上粉尘螨过敏患者体内特异性ige抗体结合，故derf1蛋白在粉尘螨过敏诊断方面有着广泛应用。
2、目前，过敏诊断方法主要有皮肤检测及血清ige检测等。其中，皮肤检测对某些患者并不友好，低致敏量抗原即能引发患者严重的过敏反应；血清ige检测具有简便快速等优点，且对患者无副作用。两种方法均需要活性好、纯度高且批间稳定的抗原制剂。现有技术所制备的抗原制剂主要包含粉尘螨天然抗原和重组抗原2种：粉尘螨天然抗原活性好，纯度及批间差难以保证；重组抗原存在抗原活性差，应用于检测试剂盒上灵敏度低、特异性差、检出率较低等问题。因此，制备活性好且具有诊断意义的derf1重组抗原显得尤为重要。
技术实现思路
1、本专利技术要解决的第一个技术问题是：针对现有技术的不足，提供一种高纯度、高活性的derf1重组抗原。
2、为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：
3、一种derf1重组抗原，其核酸序列如seq id no.1所示，所编码的氨基酸序列如seqid no.2所示。
4、作为一种改进的技术方案，所述derf1重组抗原
5、作为一种改进的技术方案，所述derf1蛋白片段i的氨基酸序列如seq id no.3所示，所述derf1蛋白片段ii的氨基酸序列如seq id no.4所示，所述derf1蛋白片段iii的氨基酸序列如seq id no.5所示。
6、本专利技术要解决的第二个技术问题是：针对现有技术的不足，提供一种derf1重组抗原的制备方法，利用该制备方法可得到纯度高，活性较强的derf1重组抗原。
7、为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：
8、一种derf1重组抗原的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
9、（1）利用在线分析工具分析，筛选出derf1蛋白的第99位至第298位的200个氨基酸、第99位至第112位的14个氨基酸以及第244位至第267位的24个氨基酸，三个片段进行串联，并在n端加上ecorⅰ酶切位点，在c端加上notⅰ酶切位点后，进行基因合成；
10、（2）分别用ecorⅰ和notⅰ酶双酶切基因合成重组derf1蛋白基因片段和ppiczαa质粒，回收酶切后的质粒片段和基因片段按照1:5的摩尔比，采用t4连接酶16℃连接2h，得连接产物；
11、（3）将步骤（2）中的连接产物转入dh5α感受态细胞,涂布于ypdz平板上，37℃恒温培养；次日随机挑取单克隆菌落，提取质粒，用ecorⅰ和notⅰ双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳验证，鉴定为阳性，即重组质粒构建成功；
12、（4）将步骤（3）中构建成功的重组质粒经sac ⅰ酶线性化，按照化学转化法转入gs115感受态细胞中，涂布于ypdz平板，30℃培养，挑取单克隆菌落，经pcr鉴定为阳性的，即为阳性表达菌；
13、（5）取步骤（4）中阳性表达菌，接种于bmgy培养基中，28℃、220rpm摇菌24h作为种子，次日接种于 bmmy培养基中，经甲醇诱导得到的发酵液，经离心收集的上清液经硫酸铵沉淀，离心收集的沉淀物经溶解、透析，收集的截留液经过滤后的滤液进入ni离子亲和层析柱中，通过梯度洗脱处理后收集的洗脱液经浓缩，即可得到derf1重组抗原。
14、作为一种改进的技术方案，步骤（4）中转化时先将240μl的pge3350加入gs115感受态细胞中，吹打混匀后于30℃水浴锅中孵育5min，之后依次加入1m 的licl36μl、2mg/ml的鲑鱼精25μl、线性化载体（10μg）50μl，吹打混匀30℃孵育30min后，42℃热激20min，室温6000rpm离心1min，收集的沉淀用500μl ypd重悬后于摇床中29℃、200rpm培养4h，培养完成后涂布于ypdz平板，30℃培养3天。
15、作为一种改进的技术方案，步骤（5）中所述 bmgy及bmmy培养基中不含有ynb及生物素。
16、作为一种改进的技术方案，步骤（5）中梯度洗脱处理是指先采用20mm咪唑的elution buffer洗脱，然后再采用250mm咪唑的elution buffer洗脱，收集250mm咪唑的elution buffer洗脱时的流出液，经过浓缩，即可得到derf1重组抗原。
17、针对现有技术的不足，提供一种der f1重组抗原在粉尘螨过敏ige抗体检测试剂盒中的应用。
18、采用了上述技术方案后，本专利技术的有益效果是：
19、本专利技术筛选出derf1蛋白的第99位至第298位的200个氨基酸、第99位至第112位的14个氨基酸以及第244位至第267位的24个氨基酸，化学合成derf1蛋白片段i、derf1蛋白片段ii以及derf1蛋白片段iii串联的基因序列，然后通过双酶切、t4连接酶的连接将得到的重组质粒经过转化、表达、纯化、浓缩，经检测得到的高纯度、活性较强的derf1重组蛋白可用于包被抗原。将该derf1重组抗原用于粉尘螨过敏ige抗体检测试剂盒中，大大提高了检测灵敏度，降低了假阳率。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种Derf1重组抗原，其特征在于，所述Derf1重组抗原的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的一种Derf1重组抗原，其特征在于，所述Derf1重组抗原为包含Derf1蛋白片段I、Derf1蛋白片段II以及Derf1蛋白片段III的重组抗原，所述Derf1蛋白片段I为Derf1蛋白中第99位至第298位的200个氨基酸，所述Derf1蛋白片段II为Derf1蛋白中第99位至第112位的14个氨基酸，所述Derf1蛋白片段III为Derf1蛋白中第244位至第267位的24个氨基酸。
3.根据权利要求2所述的一种Derf1重组抗原，其特征在于，所述Derf1蛋白片段I的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述Derf1蛋白片段II的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述Derf1蛋白片段III的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
4.一种如权利要求1所述的Derf1重组抗原的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
5.根据权利要
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）中所述 BMGY及BMMY培养基中不含有YNB及生物素。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）中梯度洗脱处理是指先采用20mM咪唑的Elution Buffer洗脱，然后再采用250mM咪唑的Elution Buffer洗脱，收集250mM咪唑的Elution Buffer洗脱时的流出液，经过浓缩，即可得到Derf1重组抗原。
8.一种如权利要求1所述的Derf1重组抗原在粉尘螨过敏IgE抗体检测试剂盒中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种derf1重组抗原，其特征在于，所述derf1重组抗原的核酸序列如seq id no.1所示，所编码的氨基酸序列如seq id no.2所示。
2.根据权利要求1所述的一种derf1重组抗原，其特征在于，所述derf1重组抗原为包含derf1蛋白片段i、derf1蛋白片段ii以及derf1蛋白片段iii的重组抗原，所述derf1蛋白片段i为derf1蛋白中第99位至第298位的200个氨基酸，所述derf1蛋白片段ii为derf1蛋白中第99位至第112位的14个氨基酸，所述derf1蛋白片段iii为derf1蛋白中第244位至第267位的24个氨基酸。
3.根据权利要求2所述的一种derf1重组抗原，其特征在于，所述derf1蛋白片段i的氨基酸序列如seq id no.3所示，所述derf1蛋白片段ii的氨基酸序列如seq id no.4所示，所述derf1蛋白片段iii的氨基酸序列如seq id no.5所示。
4.一种如权利要求1所述的derf1重组抗原的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
5....
【专利技术属性】
技术研发人员：杨致亭，孙玉可，孟德志，杨帆，刘万建，王婷，单金红，张媛媛，
申请(专利权)人：山东硕景生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。