【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种高效纯化及复性包涵体的方法。
技术介绍
1、目前基因克隆最常使用的以大肠杆菌为宿主细胞的原核表达体系，具有操作简单、生长时间快、成本低、产量高的优点，通常作为基因重组技术的首选宿主菌，然而用大肠杆菌高效表达的重组蛋白常常会形成不溶性的包涵体，包涵体是细胞内聚集成的具有膜结构的非结晶性蛋白质固体颗粒聚集体，其中除了无活性的重组蛋白外，还含有一些dna、rna及其他菌体蛋白，这种结构有利于重组蛋白不被胞内蛋白酶水解，保证了重组蛋白的高效表达，但是也存在很大弊端就是包涵体为不可溶、无生物活性、多种代谢物-蛋白复合体，需要经过洗涤、变性、复性及进一步的纯化才能获得高纯度的活性蛋白。
2、包涵体复性一般包括四个步骤：1.与细胞分离；2.变性溶解蛋白聚集；3.复性；4纯化可溶蛋白。蛋白结构彻底破坏无法恢复和变性蛋白质分子相互致聚集是蛋白质复性收率低的主要原因。因此包涵体复性的两个核心环节是：蛋白质聚集的溶解和变性溶解蛋白质的复性，这两个环节必须谨慎的选择溶解和复性条件。
3、当前包涵体溶解一般需要用强变性剂，如8m的尿素或6m的盐酸胍，通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展而可溶。但是强变性剂使多肽完全伸展，破坏了原有的二级结构，复性过程中蛋白聚集沉淀，从而导致复性蛋白浓度低，收率低，而且需要大体积的缓冲液，长时间的复性过程等问题。
技术实现思路
1、本专利技术提供一种高效纯化及复性包涵体的方法，解决
2、为实现上述目的，本专利技术提供一种高效纯化及复性包涵体的方法，包括以下步骤，菌体破碎、包涵体洗涤、包涵体溶解、包涵体纯化，包涵体复性，所述包涵体溶解步骤包括包涵体沉淀加入变性缓冲液进行重悬沉淀，震荡2h，离心取上清液，得包涵体溶解液；所述变性缓冲液包括20mmtris-hcl、1%skl、0.5%triton-x100、20mm-40mmchaps、0.5%-1%np40。
3、本专利技术通过采用添加了skl变性剂，与triton-x100、chaps、np40混合使用，使包涵体蛋白在溶解时有较高的溶解度，减少缓冲液的使用，并且对包涵体蛋白结构破坏较小，在包涵体复性时能更好的恢复原结构，包涵体复性效果更好。
4、可选的，所述包涵体复性步骤包括包涵体蛋白用缓冲液稀释至0.2-1mg/ml，加入一级复性液，保持温度为4℃，放置16h；然后装入透析袋，密封置于二级复性液，4℃透析12h，更换二级复性液继续透析12h；接着再将透析袋转入10mmpbs缓冲，4℃透析12h，更换10mmpbs缓冲继续透析12h，最后离心，收集上清，用超滤管进行超滤浓缩得到目的蛋白。
5、可选的，所述一级复性液包括0.2%-0.5%peg4000、0.4-0.6ml-精氨酸、0.5-2mm氧化型谷胱甘肽、0.5-2mm还原型谷胱甘肽。
6、可选的，所述二级复性液包括10mmtris、1mmedta。
7、可选的，所述包涵体纯化步骤包括所述包涵体溶解液上样于gst亲和层析柱，然后用含1%skl的pbs缓冲洗去杂蛋白，再经过含1%skl、20mmgsh的pbs洗脱并收集洗脱液，超滤浓缩得包涵体蛋白。
8、可选的，所述包涵体纯化：所述包涵体纯化步骤包括所述包涵体溶解液上样于his亲和层析柱，使用包括20mmtris-hcl、500mmnacl、1%skl、250mm咪唑、ph8.0的洗脱液进行洗脱并收集洗脱液，超滤浓缩后得包涵体蛋白。
9、可选的，所述包涵体洗涤步骤包括包涵体加入洗涤液中震荡洗涤1-2h，离心后得包涵体沉淀；所述洗涤液包括20mmtris-hcl、1mmedta、50mmnacl、0.5%tritonx-100、1mmdtt、ph8.0。
10、可选的，所述超声仪器为超声波破碎仪，运行条件为功率200w，超声3秒，停3秒。
11、可选的，所述离心条件为转速15000rpm，时间为20min。
12、可选的，所述菌体破碎：将菌体用20mmtris-hcl、5%甘油、ph8.0缓冲液悬浮，冰浴条件下，超声破碎菌体20min，所述菌体破碎后离心30min得包涵体。
13、本专利技术的上述技术方案至少包括以下有益效果：
14、本专利技术提供的一种高效纯化及复性包涵体的方法主要通过超声波破碎菌体，高速离心得到沉淀，优化变性剂缓冲剂的种类、浓度等条件溶解包涵体，采用1%skl代替8murea作为变性剂，不仅有较高的包涵体溶解度，并且较为温和，对蛋白结构破坏较小，能较大程度保持蛋白结构。并且增加了triton-x100、chaps和np40，与1%skl共同使用，增加临界胶束浓度，减轻skl的变性作用，可以使活性位点暴漏，使蛋白复性的时候更容易正确折叠回原结构，使包涵体复性效果更好。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种高效纯化及复性包涵体的方法，包括以下步骤，菌体破碎、包涵体洗涤、包涵体溶解、包涵体纯化，包涵体复性，其特征在于，
2.根据权利要求1所述的高效纯化及复性包涵体的方法，其特征在于，所述包涵体复性步骤包括包涵体蛋白用缓冲液稀释至0.2-1mg/mL，加入一级复性液，保持温度为4℃，放置16h；然后装入透析袋，密封置于二级复性液，4℃透析12h，更换二级复性液继续透析12h；接着再将透析袋转入10mMPBS缓冲，4℃透析12h，更换10mMPBS缓冲继续透析12h，最后离心，收集上清，用超滤管进行超滤浓缩得到目的蛋白。
3.根据权利要求2所述的高效纯化及复性包涵体的方法，其特征在于，所述一级复性液包括0.2%-0.5%PEG4000、0.4-0.6ML-精氨酸、0.5-2mM氧化型谷胱甘肽、0.5-2mM还原型谷胱甘肽。
4.根据权利要求2所述的高效纯化及复性包涵体的方法，其特征在于，所述二级复性液包括10mMTris、1mMEDTA。
5.根据权利要求1所述的高效纯化及复性包涵体的方法，其特征在于，所述包涵体纯化步骤包括所述包涵
6.根据权利要求1所述的高效纯化及复性包涵体的方法，其特征在于，所述包涵体纯化步骤包括所述包涵体溶解液上样于HIS亲和层析柱，使用包括20mMTris-HCl、500mMNaCl、1%SKL、250mM咪唑、pH8.0的洗脱液进行洗脱并收集洗脱液，超滤浓缩后得包涵体蛋白。
7.根据权利要求1所述的高效纯化及复性包涵体的方法，其特征在于，所述包涵体洗涤步骤包括包涵体加入洗涤液中震荡洗涤1-2h，离心后得包涵体沉淀；所述洗涤液包括20mMTris-HCl、1mMEDTA、50mMNaCl、0.5%Tritonx-100、1mMDTT、pH8.0。
8.根据权利要求7所述的高效纯化及复性包涵体的方法，其特征在于，所述超声仪器为超声波破碎仪，运行条件为功率200W，超声3秒，停3秒。
9.根据权利要求1所述的高效纯化及复性包涵体的方法，其特征在于，所述离心条件为转速15000rpm，时间为20min。
10.根据权利要求1所述的高效纯化及复性包涵体的方法，其特征在于，所述菌体破碎步骤包括将菌体用20mMTris-HCl、5%甘油、pH8.0缓冲液悬浮，冰浴条件下，超声破碎菌体20min，所述菌体破碎后离心30min得包涵体。
...【技术特征摘要】
1.一种高效纯化及复性包涵体的方法，包括以下步骤，菌体破碎、包涵体洗涤、包涵体溶解、包涵体纯化，包涵体复性，其特征在于，
2.根据权利要求1所述的高效纯化及复性包涵体的方法，其特征在于，所述包涵体复性步骤包括包涵体蛋白用缓冲液稀释至0.2-1mg/ml，加入一级复性液，保持温度为4℃，放置16h；然后装入透析袋，密封置于二级复性液，4℃透析12h，更换二级复性液继续透析12h；接着再将透析袋转入10mmpbs缓冲，4℃透析12h，更换10mmpbs缓冲继续透析12h，最后离心，收集上清，用超滤管进行超滤浓缩得到目的蛋白。
3.根据权利要求2所述的高效纯化及复性包涵体的方法，其特征在于，所述一级复性液包括0.2%-0.5%peg4000、0.4-0.6ml-精氨酸、0.5-2mm氧化型谷胱甘肽、0.5-2mm还原型谷胱甘肽。
4.根据权利要求2所述的高效纯化及复性包涵体的方法，其特征在于，所述二级复性液包括10mmtris、1mmedta。
5.根据权利要求1所述的高效纯化及复性包涵体的方法，其特征在于，所述包涵体纯化步骤包括所述包涵体溶解液上样于gst亲和层析柱，然后用含1%skl的pbs缓冲洗去杂蛋白，再经过含1%skl、20mmgsh的pbs洗脱并收集洗...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑雪松，孙建伟，孔泽凯，李娜，胡学钻，闫彩霞，陈莹，张强刚，黄超超，黄祥宏，
申请(专利权)人：武汉贝茵莱生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。