【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及靶向bcma低表达肿瘤的纳米抗体及car-t和应用。
技术介绍
1、b细胞成熟抗原(b-cell maturation antigen,bcma),也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员17(tnfrs17)或cd269，bcma是在浆细胞和已分化的浆细胞表面特异性表达的蛋白，由185个氨基酸残基组成了其胞外结构域，在b细胞成熟和分化为浆细胞中起主要作用。bcma是肿瘤坏死因子超家族的增殖诱号配体(a proliferation-inducing ligand,april)和b细胞活化因子(b-cell activating factor,baff)的受体。二者均可触发nf-κb信号传导，增加促存活的bcl-2家族基因的表达和促凋亡基因的下调，此外bcma可激活jnk、mapk8信号通路，这些信号通路参与调节体液免疫，b细胞发育和稳态，促进b细胞在不同发育阶段的存活，是调节b细胞增殖、成熟和分化成浆细胞的关键。
2、多发性骨髓瘤(multiple myeloma，mm)是仅次于非霍奇金淋巴瘤的第二大血液恶性肿瘤，其特征是骨髓中恶性浆细胞异常增生和溶骨性骨病变。相关的临床症状包括溶骨性病变、贫血、肾功能不全、高钙血症、感染和其他相关的器官功能障碍。在正常人体组织中，bcma蛋白和mrna几乎只发现在浆细胞上，但其在在浆细胞恶性转化过程中选择性地过度表达，高表达于多发性骨髓瘤细胞表面，并且mm患者的血清中bcma水平升高，促进肿瘤细胞生长、存活和耐药性的发生，主要通过激活nf-κb、akt、磷脂酰肌
3、1993年在骆驼科动物和鲨鱼的血清中分离出一种仅有重链可变区(variabledomain of the heavy chain of hcab，vhh)和两个ch2和ch3区的抗体，该抗体被称为单域抗体(singledomain antibody，sdab)，又称纳米抗体，它在分子大小、稳定性、溶解度、穿透性等方面都优于常规抗体。这种纳米抗体单独表达vhh结构，但仍然保留了对原始重链完整的抗原特异性和结合亲和力，是目前已知的可结合抗原的最小抗体片段。因此纳米抗体可在疫苗研发、疾病诊断和治疗中发挥优势。虽然纳米抗体相较于常规抗体具有众多的优点已被广泛证实，但纳米抗体如何在实际临床应用中发挥更好更稳定的作用，目前还有众多疑问未被完全掌握。以及什么类型的纳米抗体具有好的效果目前没有标准的答案，依然需要研究人员付出大量的时间和精力去探索。
4、综上所述，本领域仍需开发抗bcma的新纳米抗体及相关应用，以缓解目前医疗技术在治疗多发性骨髓瘤中存在的不足。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种具有适度亲和力的抗人bcma纳米抗体及car-t和应用，具体方案如下。
2、一种抗人bcma纳米抗体，所述抗人bcma纳米抗体包括重链可变区；所述重链可变区包括骨架区和互补决定区，所述重链可变区的序列如seq id no.1～10所示。
3、进一步，所述抗人bcma纳米抗体的亲和力kd值范围为1.0×10-11～9.1×10-12。
4、一种靶向多发性骨髓瘤的car-t细胞，所述car-t细胞包含上述的抗人bcma纳米抗体。
5、进一步，所述car-t细胞还包括cd8信号肽、铰链区、人源cd8跨膜区、人源4-1bb共刺激信号区和人源cd3ζ信号结构域。
6、进一步，所述car-t细胞靶向bcma抗原高表达和bcma抗原低表达的多发性骨髓瘤细胞。
7、上述抗人bcma纳米抗体的制备方法，包括如下步骤：
8、步骤1：以包含人bcma基因全长序列的质粒为模板，利用真核表达体系制备特异性靶向bcma的重组蛋白；
9、步骤2：用步骤1制备的重组蛋白来免疫动物，提取免疫后动物外周血淋巴细胞的总rna，将所述总rna反转录为cdna，再用巢式pcr进行两轮扩增，第一轮巢式pcr扩增的引物如seq id no.11和seq id no.12所示；第二轮巢式pcr扩增的引物如seq id no.13和seqid no.14所示，获得纳米抗体基因并克隆至噬菌体展示载体构建噬菌体纳米抗体文库；
10、步骤3：利用噬菌体展示技术，使用步骤1制备的特异性靶向bcma重组蛋白淘选步骤2中构建的纳米抗体，并鉴定能特异性结合bcma蛋白的纳米抗体；
11、步骤4：将淘选出的特异性靶向bcma的纳米抗体进行亲和力检测。
12、进一步，筛选出步骤4中亲和力kd值范围为1.0×10-12～4.0×10-12的纳米抗体。
13、所述抗人bcma纳米抗体在制备靶向多发性骨髓瘤、b淋巴细胞恶性肿瘤、慢性淋巴细胞白血病、弥漫性大b细胞淋巴瘤、视神经脊髓炎谱系疾病、人类类风湿性关节炎、多发性硬化症或系统性红斑狼疮的药物中的应用。
14、所述car-t细胞在制备靶向多发性骨髓瘤、b淋巴细胞恶性肿瘤、慢性淋巴细胞白血病、弥漫性大b细胞淋巴瘤、视神经脊髓炎谱系疾病、人类类风湿性关节炎、多发性硬化症或系统性红斑狼疮的药物中的应用。
15、b细胞激活因子(baff；blys；tall-1)和增殖诱导配体(april)是肿瘤坏死因子(tnf)超家族的两个同源成员，其在红斑狼疮、类风湿关节炎和其他自身免疫性疾病的病理学中都发挥了一定的作用。现有研究证据表明，骨髓微环境中这两种细胞因子的产生对骨髓瘤细胞的生存和增殖起着关键作用。baff和april都是位于骨髓瘤细胞表面跨膜激活剂和钙调节剂，而b细胞成熟抗原(bcma)是这两个tnf受体家族成员的配体。因此，能够特异性靶向bcma蛋白的纳米抗体，理论上也可以对所述红斑狼疮、类风湿关节炎和其他自身免疫性疾病发挥作。
16、进一步，所述多发性骨髓瘤包括bcma抗原高表达和bcma抗原低表达的多发性骨髓瘤。
17、有益技术效果
18、本专利技术方法制备得到的纳米抗体，具有适中的亲和力，其制备的car-t能对bcma阳性表达的肿瘤细胞发挥有效的杀伤作用。其中，用本专利技术提供的纳米抗体制备得到的car-t的car阳性表达率高达80.1％，远远高于常规car的37.1％。
19、此外，用本专利技术的纳米抗体制备的car-t对bcma抗原高表达和bcma抗原低表达的多发性骨髓瘤细胞均能发挥杀伤作用，甚至对bcma抗原相对低表达的多发性骨髓瘤细胞能发挥出更好的裂解效率。由此说明本专利技术提供的纳米抗体及制备的car-t能在多发性骨髓瘤及自发性免疫疾病的治疗中发挥巨大的临床潜力。
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1.一种抗人BCMA纳米抗体，其特征在于，所述抗人BCMA纳米抗体包括重链可变区；所述重链可变区包括骨架区和互补决定区，所述重链可变区的序列如SEQ ID NO.1～10所示。
2.如权利要求1所述的抗人BCMA纳米抗体，其特征在于，所述抗人BCMA纳米抗体的亲和力KD值范围为1.0×10-11～9.1×10-12。
3.一种靶向多发性骨髓瘤的CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞包含权利要求1所述的抗人BCMA纳米抗体。
4.如权利要求3所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞还包括CD8信号肽、铰链区、人源CD8跨膜区、人源4-1BB共刺激信号区和人源CD3ζ信号结构域。
5.如权利要求3所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞靶向BCMA抗原高表达和BCMA抗原低表达的多发性骨髓瘤细胞。
6.权利要求1所述的抗人BCMA纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，筛选出步骤4中亲和力KD值范围为1.0×10-12～4.0×1
8.权利要求1所述的抗人BCMA纳米抗体在制备靶向多发性骨髓瘤、B淋巴细胞恶性肿瘤、慢性淋巴细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、视神经脊髓炎谱系疾病、人类类风湿性关节炎、多发性硬化症或系统性红斑狼疮的药物中的应用。
9.权利要求3所述的CAR-T细胞在制备靶向多发性骨髓瘤、B淋巴细胞恶性肿瘤、慢性淋巴细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、视神经脊髓炎谱系疾病、人类类风湿性关节炎、多发性硬化症或系统性红斑狼疮的药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述多发性骨髓瘤包括BCMA抗原高表达和BCMA抗原低表达的多发性骨髓瘤。
...【技术特征摘要】
1.一种抗人bcma纳米抗体，其特征在于，所述抗人bcma纳米抗体包括重链可变区；所述重链可变区包括骨架区和互补决定区，所述重链可变区的序列如seq id no.1～10所示。
2.如权利要求1所述的抗人bcma纳米抗体，其特征在于，所述抗人bcma纳米抗体的亲和力kd值范围为1.0×10-11～9.1×10-12。
3.一种靶向多发性骨髓瘤的car-t细胞，其特征在于，所述car-t细胞包含权利要求1所述的抗人bcma纳米抗体。
4.如权利要求3所述的car-t细胞，其特征在于，所述car-t细胞还包括cd8信号肽、铰链区、人源cd8跨膜区、人源4-1bb共刺激信号区和人源cd3ζ信号结构域。
5.如权利要求3所述的car-t细胞，其特征在于，所述car-t细胞靶向bcma抗原高表达和bcma抗原低表达的多发性骨髓瘤细胞。
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【专利技术属性】
技术研发人员：杨寒朔，
申请(专利权)人：成都赛恩吉诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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