一种双嵌合抗原受体、T细胞及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种双嵌合抗原受体、T细胞及其构建方法与应用，属于肿瘤的细胞免疫治疗领域。本发明专利技术具体涉及了这种双嵌合抗原受体T细胞(dCAR‑T细胞)的具体结构以及构建方法，并初步探讨了这种dCAR‑T细胞的体内与体外活性。选择的肿瘤相关性抗原为间皮素和癌胚抗原，研究表明这两种肿瘤抗原会同时表达在实体瘤表面，例如胰腺癌。本发明专利技术构建的抗原受体，通过体外和体内试验，证实构建的dCAR‑T细胞只有在同时识别两个抗原的情况下才能够持久性被有效地激活，而且具有高效的抗肿瘤活性，进而能够发挥特异性肿瘤杀伤功能，提高CAR‑T细胞免疫治疗的应用。

A double chimeric antigen receptor, T cell and its construction method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种双嵌合抗原受体、T细胞及其构建方法与应用
本专利技术属于肿瘤的细胞免疫治疗领域，更具体地说，涉及本专利技术涉及肿瘤的细胞免疫治疗领域。构建一种双嵌合抗原受体(dual-receptorCAR，dCAR)、T细胞及其构建方法和应用。
技术介绍
随着细胞免疫学的不断发展，免疫T细胞在缓解肿瘤发展以及清除肿瘤方面的作用日益受到科学家的重视。研究发现，使用内源性T细胞进行肿瘤免疫治疗时，肿瘤细胞的靶抗原需要经过其表面的主要组织相容性复合物(mainhistocompatibilitycomplex，MHC)的加工递呈后才能被体内T细胞表面的受体所识别，使得肿瘤细胞被清除，即T细胞发挥功能具有“MHC限制性”的特性。然而，肿瘤免疫编辑的过程会使肿瘤细胞表面的MHC分子表达量显著降低，破坏了抗原的加工和递呈，降低肽段免疫原性，阻碍了T细胞的识别和激活，使肿瘤细胞成功地躲避T细胞的攻击，最终导致肿瘤的快速增殖，这就是肿瘤的免疫逃逸机制。为了提高T细胞杀伤肿瘤的能力，利用基因重组技术将靶向肿瘤抗原的特异性嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，CAR)融合到T细胞(以下简称CAR-T细胞)基因组中，这种途径在体外和临床试验中显示出良好的靶向性、杀伤活性和持久性，为过继性细胞免疫治疗提供了新的有效解决方案，展示了巨大的应用潜力和发展前景。相对于传统T细胞表面受体(TCR)而言，CAR结构及作用机理已大大简化。CAR主要由胞外抗原识别区、跨膜区和胞内信号转导区三部分组成。胞外抗原识别区是由单克隆抗体的轻链(VL)和重链(VH)以及带韧性的铰链区组成的单链抗体可变区(singlechainfragmentvariable，scFv)，跨膜区一般由同源或异源的CD3、CD8或CD28二聚体膜蛋白组成，胞内信号转导区是免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotifs，ITAMs)，通常为CD3ζ。一旦胞外scFv识别肿瘤相关抗原(tumorassociatedantigen，TAA)通过信号传导通路激活T细胞，使其释放颗粒酶和穿孔素，最终达到杀死肿瘤细胞的作用。目前，临床上CAR-T细胞疗法在急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、肝癌、肺癌等恶性血液瘤和实体瘤的治疗中都显示出良好的治疗效果，尤其针对血液瘤。目前，CAR-T细胞技术发展至今主要经历了四代。早在1989年，第一代CAR是由免疫球蛋白scFv和CD3复合物(ζ链)胞内结构域融合形成嵌合受体，改造的T细胞以抗原依赖、非MHC限制的方式结合肿瘤抗原，启动并活化特异性杀伤肿瘤反应。虽然第一代CAR-T细胞研究较多，但是大多数试验在细胞扩增、体内存活时间、细胞因子分泌等方面还存在不足，没有达到预期的临床效果。研究表明，T细胞的完全活化有赖于它的双信号通路，即抗原识别信号通路和协同刺激信号通路，主要是其表面受体TCR识别抗原肽-MHC复合物以及CD28共刺激分子与靶细胞上B7分子相互作用，促进IL-2的合成，使得T细胞充分活化。对于仅含有CD3ζ信号域的CAR-T细胞不能被彻底激活，从而大大削弱了CAR-T细胞的功能。因此，依照T细胞活化的双信号学说，第二代CAR在结构上添加一个共刺激分子，如CD28和CD137(4/1BB)等，从而提高了T细胞的细胞毒性及延长体内持续时间。第三代CAR添加了两个共刺激分子，临床上显示这种CAR-T细胞具有很强的肿瘤细胞清除能力，但面临着严重的安全性问题，主要是细胞因子释放综合征。CD28分子在调节淋巴细胞增殖和存活方面有着重要作用，尤其对CAR-T细胞的初期活性具有很强的爆发力；4/1BB则为维持T细胞应答提供信号，能极大地提高CAR-T细胞在在体内的持续时间。目前，CAR-T细胞技术在治疗慢淋性白血病、急性白血病以及淋巴瘤有较好的治疗效果，但在实体瘤上的效果欠佳。究其原因，这与实体肿瘤的发生发展有密切关系，肿瘤细胞周围会形成一个具有很强免疫抑制功能的微环境。在这个微环境中，存在许多具有抑制功能的调节性T细胞、M2型肿瘤相关巨噬细胞和髓源性抑制细胞，肿瘤本身异常高表达的一些抑制分子(例如：PD-L1)以及分泌的抑制性细胞因子等(例如，TGF-β和IL-10)。在这种情况下，CAR-T细胞归巢到肿瘤组织部位的能力就被大大削弱。针对这种研究瓶颈，第四代CAR-T是在第二CAR-T的基础上共表达了一些细胞因子和，如：IL-12或HPSE，这些因子能够很好的克服免疫抑制微环境，有望成为实体肿瘤治疗中的重要手段。目前，临床上CART细胞治疗面临的一个严重的副反应是靶向非肿瘤毒性。究其原因，针对CAR结构的肿瘤特异性抗原非常稀少，而且很难分离得到。而肿瘤相关性抗原(tumorassociatedantigen，TAA)不仅存在于肿瘤细胞表面，同时也存在于某些正常组织中。因此，应用TAA设计的CAR-T细胞回输体内以后，不仅能够杀死肿瘤细胞，而且也会对正常组织产生损伤。这种毒副作用在临床上已引起了医生和病人的高度重视，也会对CAR-T细胞技术的应用产生负面影响。如何利用现有的TAA来提高CAR-T细胞的安全性是目前临床面临的首要问题。间皮素(mesothelin，MSLN)，是一种分子量为40kDa的肿瘤相关性抗原，常表达于正常的胸膜、心包和腹膜的间皮细胞，但同时也会高表达于多种恶性肿瘤组织中。研究表明，间皮素广泛表达于间皮瘤、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、胆管癌、胃癌、乳腺癌等实体瘤。因此，在肿瘤的免疫治疗中，常把间皮素作为一个广谱的TAA。癌胚抗原(carcion-embryonicantigen，CEA)是一种分子量为22kDa的多糖蛋白复合物，CEA是一种非器官特异性的肿瘤相关抗原，最初由胎儿肠胃道上皮组织、胰腺和肝脏细胞合成，出生后血清中含量大幅度降低。在正常成人的小肠、肝脏、脾脏等组织中有少量表达，但在结直肠癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、乳腺癌等中的表达量会随恶性程度大幅度提升，因此，它也可以作为一种广谱的TAA。目前，通过生物信息学手段发现在某些肿瘤细胞中会同时过表达多种TAA，例如，胰腺癌、肺癌以及乳腺癌等肿瘤类型中都会同时高表达MSLN和CEA两种抗原。相对而言，对于正常组织甚至是肿瘤癌旁组织同时表达两种TAA的几率比较低，它们往往仅过表达一种TAA，这也是为目前采用单CAR结构T细胞最终会导致严重的正常组织损伤的原因。开发具有双靶向功能的T细胞，只有在同时识别两种抗原的前提下才能彻底激活T细胞，进而发挥抗肿瘤的效果，而对正常组织只产生轻微损伤，甚至不产生损伤。
技术实现思路
1.要解决的问题针对目前CAR-T细胞治疗过程中出现的正常组织损伤的毒性，本专利技术提供了一种应用抗人源MSLN单链抗体(hMSLNscFv)和抗人源CEA单链抗体(hCEAscFv)构建出的双嵌合抗原受体，下游分别单独偶联了T细胞激活信号通路的CD3ζ及4/1BB信号域，通过独特的电转方式转染T淋巴细胞的方法。研究了修饰后T细胞的有效性及安全性，只有同时识别M本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双嵌合抗原受体，其特征在于：所述的双嵌合抗原受体由针对MSLN的第一嵌合抗原受体和针对CEA的第二嵌合抗原受体组成。/n

【技术特征摘要】
20180702 CN 20181070818071.一种双嵌合抗原受体，其特征在于：所述的双嵌合抗原受体由针对MSLN的第一嵌合抗原受体和针对CEA的第二嵌合抗原受体组成。


2.根据权利要求1所述的一种双嵌合抗原受体，其特征在于：所述的第一嵌合抗原受体包括人MSLN单克隆抗体的轻链和重链可变区hMSLNscFv和信号传导结构域；所述的MSLNscFv序列为序列列表中的SEQIDNO.1或与其具有80％序列相似度的变体；所述的信号传导结构域由铰链区、跨膜区和胞内信号域串联构成。


3.根据权利要求2所述的一种双嵌合抗原受体，其特征在于：所述的MSLN单克隆抗体的轻链和重链可变区MSLNscFv在轻链和重链之间设置一个linker，该linker可以是不同的氨基酸序列，优选为GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerSerGlyGlyGlySer连接肽。


4.根据权利要求2所述的一种双嵌合抗原受体，其特征在于：所述的第一嵌合抗原受体的铰链区为CD8α铰链；所述跨膜区为人CD3跨膜区、人CD8跨膜区或人CD28跨膜区；所述的信号传导胞内区由共刺激信号结构域CD137(4/1BB)组成。


5.根据权利要求2所述的一种双嵌合抗原受体，其特征在于：所述的第一嵌合抗原受体的上游含有一个信号肽，所述的信号肽的氨基酸序列如序列列表中的SEQIDNO.2所示，其对应的核苷酸序列如序列列表中的SEQIDNO.3所示。


6.根据权利要求2或4所述的一种双嵌合抗原受体，其特征在于：所述的第一嵌合抗原受体的信号传导结构的氨基酸序列如序列列表中的SEQIDNO.4所示，其对应的核苷酸序列如序列列表中的SEQIDNO.5所示。


7.根据权利要求1所述的一种双嵌合抗原受体，其特征在于：所述的第二嵌合抗原受体包括人CEA单克隆抗体的轻链和重链可变区hCEAscFv和信号传导结构域；所述的CEAscFv序列为序列列表中的SEQIDNO.6或与其具有80％序列相似度的变体；所述的信号传导结构域由铰链区、跨膜区和胞内信号域串联构成。


8.根据权利要求7所述的一种双嵌合抗原受体，其特征在于：所述的CEA单克隆抗体的轻链和重链可变区CEAscFv在轻链和重链之间设置一个linker，该linker可以是不同的氨基酸序列，优选为GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerSerGlyGlyGlySer连接肽。


9.根据权利要求7所述的一种双嵌合抗原受体，其特征在于：所述的第二嵌合抗原受体的铰链区为CD8α铰链；所述跨膜区为人CD3跨膜区、人CD8跨膜区或人CD28跨膜区；所述的信号传导胞内区由抗原识别信号结构域CD3ζ组成。


10.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐寒梅，杨培伟，迟骁玮，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32