自断蛋白的活性控制及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种在无酵素参与下，具自断能力的自断蛋白，以及如何控制该自断蛋白来生产目标蛋白的方法。自断蛋白主体为一内含蛋白，所述内含蛋白的N端氨基酸包含至少有一突变，本发明专利技术的自断蛋白在“抑制条件”下，自断蛋白不会产生自我断裂，在“促进条件”下，自断蛋白的C‑端会产生自我断裂，而N‑端则不会产生自我断裂。本发明专利技术另提供一种含有该自断蛋白及目标蛋白的融合蛋白。

Activity control and application of self breaking protein

【技术实现步骤摘要】
自断蛋白的活性控制及其应用
本专利技术是有关于一种自断蛋白，包含此自断蛋白的融合蛋白，以及控制自断蛋白生产目标蛋白的方法。【先前技术】内含蛋白是一种天然存在的自我剪接蛋白结构域，功能为从较大的蛋白质结构中自我切除，同时将两侧的胜肽“外显子(exteins)”连接在一起形成成熟的宿主蛋白。内含蛋白因可重新排列两侧的键结，造就出许多使用内含蛋白的生物技术。这些技术包括各种类型的蛋白质连接、活化，以及蛋白质标记和追踪应用。内含蛋白还有一个重要应用是生产、纯化重组蛋白。特别是，内含蛋白具有自我切除的能力，因此可为研究、医疗及其他商业上应用做出重大的应用。传统的标签序列为纯化目标蛋白提供了简单而有力的方式，可利用简单的基因重组技术与目标蛋白融合。这些标签已广泛地使用于现在的研究中，并且成为研发与制造的主要平台。然而，虽然目标蛋白可在适当的宿主细胞中表现，并利用标签序列纯化，但标签序列的存在可能会降低目标蛋白的活性，并可能产生不需要的免疫原性。因此，在纯化后将亲和性标签去除是非常重要的，一般是利用高特异性的内切酶进行切除。虽然这些酵素通常有效，但是酵素过于昂贵，对于量产不利，且需要额外的步骤来去除这些酵素。因此，内含蛋白提供一般标签自我切割的能力是一项重大进步，已有一些文献揭示使用内含蛋白的自我切割能力来移除亲和性标签序列的系统。然而，此方法仍然存在一些重大缺点，以阻碍内含蛋白的应用。例如，在蛋白质表现及纯化的过程必须确实抑制内含蛋白的自我切割反应，但一旦要纯化目标蛋白，则需要控制反应能快速完成；在常见的内含蛋白中，经常需要额外添加硫醇化合物(如，二硫苏糖醇)来诱发断裂，增加成本及事后移除的程序。因此，业界需要一种稳定、不需额外填加酵素或硫醇化合物、低成本的蛋白质纯化的方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供一种自断蛋白、包含此自断蛋白的融合蛋白，以及利用此自断蛋白生产目标蛋白的方法。本专利技术提供一种自断蛋白，包括内含蛋白，其中所述的内含蛋白的N-端氨基酸至少包含一个突变，移除N-端自我断裂活性，只保留C-端自我断裂活性，通过调控盐浓度、pH值和温度控制自断蛋白的活性。在本专利技术实施例中，所述内含蛋白的N端突变，氨基酸经置换、删除、插入及/或取代。在本专利技术实施例中，所述内含蛋白源自于NpuDnaE。在本专利技术实施例中，所述内含蛋白N端第1个氨基酸由半胱氨酸(Cys)置换为甘氨酸(Gly)或丙氨酸(Ala)。在本专利技术实施例中，所述自断蛋白的序列由下列族群组成:SEQIDNO:1或/和SEQIDNO:2。在本专利技术实施例中，所述自断蛋白的序列为:GLSYETEILTVEYGLLPIGKIVEKRIECTVYSVDNNGNIYTQPVAQWHDRGEQEVFEYCLEDGSLIRATKDHKFMTVDGQMLPIDEIFERELDLMRVDNLPNIKIATRKYLGKQNVYDIGVERDHNFALKNGFIASN在本专利技术实施例中，所述自断蛋白的序列为:ALSYETEILTVEYGLLPIGKIVEKRIECTVYSVDNNGNIYTQPVAQWHDRGEQEVFEYCLEDGSLIRATKDHKFMTVDGQMLPIDEIFERELDLMRVDNLPNIKIATRKYLGKQNVYDIGVERDHNFALKNGFIASN本专利技术另提供一种融合蛋白，具有下列式(I)结构：(X)n-(I)-(P)m(I)其中，X为氨基酸序列、连接子、磁珠或其类似物，I为上述的自断蛋白，P为目标蛋白，n为0以上的整数，以及m为1以上的整数。在本专利技术实施例中，所述X为标签序列，此标签序列包括His-Tag、GST-Tag，或其他可供协助纯化及表现的氨基酸序列。较佳的标签序列為有利于在pH值中性至酸性条件下收集、纯化该融合蛋白。在本专利技术实施例中，此目标蛋白P包括多肽、蛋白质、重组蛋白、抗体、酵素或激素。本专利技术另提供一种蛋白质表达载体，包含本专利技术所述自断蛋白的核苷酸序列。在本专利技术实施例中，此蛋白质表达载体包括His-Tag、GST-Tag或其他可供协助纯化及表现的氨基酸的核苷酸序列。较佳的标签序列為有利于在pH值中性至酸性条件下收集、纯化该融合蛋白。在本专利技术实施例中，本专利技术的自断蛋白的核苷酸序列由下列族群组成:SEQIDNO:3或/和SEQIDNO:4。在本专利技术实施例中，此自断蛋白的核苷酸序列为:GGCCTGAGCTATGAAACCGAAATTCTGACCGTGGAATATGGCCTGCTGCCGATTGGTAAAATTGTGGAAAAACGCATCGAATGTACTGTTTATAGCGTTGATAATAATGGCAATATTTATACCCAGCCGGTGGCACAGTGGCACGATCGCGGCGAACAGGAAGTGTTTGAATATTGTCTGGAAGATGGTAGCCTGATTCGCGCAACCAAAGACCATAAATTTATGACTGTTGATGGTCAGATGCTGCCGATTGATGAAATTTTTGAACGTGAACTGGATCTGATGCGCGTTGATAATCTGCCGAATATCAAAATTGCGACCCGTAAATATCTGGGCAAACAGAATGTGTATGACATTGGCGTTGAACGCGACCATAATTTTGCGCTGAAAAATGGCTTCATTGCTTCTAAT在本专利技术实施例中，此自断蛋白的核苷酸序列为:GCGCTGAGCTATGAAACCGAAATTCTGACCGTGGAATATGGCCTGCTGCCGATTGGTAAAATTGTGGAAAAACGCATCGAATGTACTGTTTATAGCGTTGATAATAATGGCAATATTTATACCCAGCCGGTGGCACAGTGGCACGATCGCGGCGAACAGGAAGTGTTTGAATATTGTCTGGAAGATGGTAGCCTGATTCGCGCAACCAAAGACCATAAATTTATGACTGTTGATGGTCAGATGCTGCCGATTGATGAAATTTTTGAACGTGAACTGGATCTGATGCGCGTTGATAATCTGCCGAATATCAAAATTGCGACCCGTAAATATCTGGGCAAACAGAATGTGTATGACATTGGCGTTGAACGCGACCATAATTTTGCGCTGAAAAATGGCTTCATTGCTTCTAAT本专利技术另提供一种生产、纯化蛋白质的方法，包括:(a)在宿主中表达上述融合蛋白；(b)在抑制条件下收集、纯化所述融合蛋白；(c)将所述融合蛋白置于促进条件，使所述融合蛋白中的自断蛋白自C-端断裂，且目标蛋白与所述自断蛋白分离；以及(d)收集、纯化所述目标蛋白。在本专利技术实施例中，所述抑制条件为pH值中性至酸性条件。在本专利技术实施例中，所述抑制条件本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种自断蛋白，包括一内含蛋白，其特征是，所述内含蛋白的N端第1个氨基酸有一突变，其中所述内含蛋白源自于NpuDnaE。/n

【技术特征摘要】
20180629 TW 1071226751.一种自断蛋白，包括一内含蛋白，其特征是，所述内含蛋白的N端第1个氨基酸有一突变，其中所述内含蛋白源自于NpuDnaE。


2.如权利要求1所述的自断蛋白，其特征是，所述突变包括置换、删除、插入及/或取代。


3.如权利要求1所述的自断蛋白，其特征是，所述内含蛋白N端第1个氨基酸半胱氨酸(Cys)经由所述突变而改变N端序列，造成所述内含蛋白失去N-端自我断裂活性。


4.如权利要求1所述的自断蛋白，其特征是，所述自断蛋白的序列系包括:SEQIDNO:1或SEQIDNO:2。


5.一种融合蛋白，具有下式(I)结构：
(X)n-(I)-(P)m(I)
其中，
X为氨基酸序列、连接符、磁珠或其类似物；
I为权利要求1所述的自断蛋白；
P为目标蛋白；
n为0以上的整数；以及
m为1以上的整数。


6.如权利要求5所述的融合蛋白，其特征是，所述X为一标签序列，所述标签序列包括任何供协助纯化及表达的氨基酸序列。


7.如权利要求6所述的融合蛋白，其特征是，所述标签序列包括但不限于His-Tag或GST-Tag。


8.如权利要求5所述的融合蛋白，其特征是，所述目标蛋白为多肽、蛋白质、重组蛋白、抗体、酵素或激素。


9.一种蛋白质表达载体，其特征是，所述蛋白质表达载体包含如权利要求1所述的自断蛋白的核苷酸序列。


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【专利技术属性】
技术研发人员：李翊荣，苏士哲，
申请(专利权)人：苏士哲，
类型：发明
国别省市：中国台湾;71