一种特异性活化NK细胞的嵌合抗原受体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物医药领域，具体是一种针对NK细胞信号转导特点特异性优化的嵌合抗原受体及其用途，所述的嵌合抗原受体scFv由轻链和重链可变区构成，通过CD8铰链结构连接在NKp44跨膜区上，胞内段活化信号转导结构域由CD3ζITAM基序、2B4活化基序、DNAM1活化基序与DAP10活化基序串联构成。该嵌合抗原受体用于修饰自然杀伤(NK)细胞，修饰后的NK细胞(CAR‑NK)能用于肿瘤特异性抗原阳性的肿瘤治疗。在杀伤试验中，该结构相较于经典的第三代T‑CAR结构明显加强了NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，在体内模型中展现出良好的抗肿瘤活性。

A chimeric antigen receptor specifically activated NK cells and its application

【技术实现步骤摘要】
一种特异性活化NK细胞的嵌合抗原受体及其应用
本专利技术涉及生物医药领域，具体地说，是一种根据NK细胞活化信号转导机制改良而来的嵌合抗原受体及其应用。
技术介绍
自宾夕法尼亚大学CarlJune教授专利技术CAR-T细胞疗法后(CTL-019)，国际上已有多家生物技术公司开展了对CAR-T的进一步探索。最早进行CAR-T细胞治疗开发的三巨头为诺华、KitePharma以及JunoTherapeutics，最初对CAR-T的研究多集中于血液相关肿瘤。随着研究进一步深入，更多新靶点、新技术、新治疗领域的探索层出不穷，在取得令人振奋的临床试验疗效的同时，安全性也成为困扰CAR-T进步的一大难题：细胞因子风暴、脱靶效应、严重的过敏反应和神经毒性，已经病毒载体带来的安全隐患严重限制了CAR-T的广泛应用。2017年初，因治疗患者出现多例脑水肿死亡，Juno不得不终止对其核心品种JTC015的开发。因此寻找高效低毒的CAR载体细胞成为肿瘤免疫中关注的热点问题。NK细胞是固有免疫系统的重要效应细胞。NK细胞不需要抗原预先致敏即可发挥极高的细胞杀伤活性，且不受MHC限制性；成熟NK细胞不分泌IL-6，生理周期短，不引起GVHD反应。NK细胞是固有免疫系统的重要效应细胞。NK细胞不需要抗原预先致敏即可发挥极高的细胞杀伤活性，且不受MHC限制性；成熟NK细胞不分泌IL-6，生理周期短，不引起GVHD反应。骨髓移植中的研究表明，血液系统肿瘤可以有效的被同种异体的NK细胞识别和杀伤，可显著增加的疾病控制、降低复发率。尽管如此许多肿瘤细胞常通过表达非经典HLAI类分子、表达免疫抑制性配体、分泌免疫抑制性因子等方式获得免疫逃逸的能力，NK过继性治疗的临床表现不佳。所以在NK细胞中引入CAR修饰，引导NK细胞对肿瘤细胞靶向杀伤成为改进NK过继性治疗的重要策略。这新疗法有望对传统手术、化疗和放疗无效的患者提供全新的治疗方案，为肿瘤患者提供了新的治愈希望。目前临床中所使用的CAR-NK中的嵌合抗原受体结构主要沿用了CAR-T第二代和第三代的结构，虽然NK细胞的诸多生物学行为与T细胞类似，但也有其独特的信号转导模式，其中多种激活型受体可以通过多种途径活化NK细胞，且信号之间具有叠加效应。NK细胞活化受体主要包括NCR家族、自然杀伤细胞2家族、共受体家族、杀伤细胞免疫球蛋白样受体家族等。NK细胞裂解功能激活受体被称之为“自然细胞毒活性受体”(NCR)，其在肿瘤和病变细胞的非MHC限制性细胞毒活性中发挥关键作用。目前已经鉴定了三种NK细胞激活表面受体，包括NKp46、NKp30和NKp44，NCR与特异性抗体相互作用可以显著增强NK细胞的杀伤活性。NCR丰度也决定了NK细胞的杀伤活性自然杀伤细胞2家族(NKG2family)受体属于C型凝集素样受体超家族，其分子结构均由由C型凝集素样结构域，跨膜结构域和细胞质片段组成；根据NKG2受体的细胞质结构域中是否存在ITAM基序，NKG2受体分类为活化或抑制受体；识别HLA-E后分别通过ITAM或ITIM基序向NK细胞内传递不同信号。该家族成员不仅表达于NK细胞表面，也表达与T细胞。NK细胞细胞毒活性的激活还有其他重要的分子，如DNAM-1、NKp80、2B4和CRACC等。上述分子属于共受体，共受体无法单独活化NK细胞，它们的活化功能依赖于其他活化型受体，在活化过程放大活化信号，更有效促进NK细胞活化。以白细胞粘附分子DNAM-1为例，具有两个Ig样结构域的胞外部分，胞质部分含有三个酪氨酸残基；DNAM-1交联后，酪氨酸发生磷酸化并激活NK细胞的细胞毒活性。NK细胞的活化受经典MHCI类分子的调节，杀伤细胞免疫球蛋白样受体是参与这一过程主要的NK细胞表面分子。KIR家族包含激活和抑制性成员：抑制性KIR的特征在于携带两个ITIM的长胞质尾；激活受体缺乏ITIM，并且含有可与携带ITAM基序的衔接分子交联短胞质尾。这些活化的细胞表面受体能够通过胞浆内免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)，或通过跨膜区电荷作用与带有ITAM基序的接头分子相互作用，促进NK细胞的活化。目前临床中所使用的CAR-NK中的嵌合抗原受体结构主要沿用了CAR-T第二代和第三代的结构，目前针对NK细胞活化信号转导的CAR结构改造尚缺乏研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种针对NK细胞信号转导特点特异性优化的嵌合抗原受体结构，在第三代CAR的结构基础上，对嵌合抗原受体的胞内段与跨膜区进行了优化。该CAR在以NK细胞为载体的情况下可以极大程度提高细胞的杀伤活性。为了实现上述目的，本专利技术提供一种全新的、以NK细胞活化信号为生物学基础的嵌合抗原受体结构。具体来说是在第三代CAR的结构基础上，对胞内段进行了改良，串联了多个活化结构域，并将CD28跨膜区分别替换为可以与接头蛋白作用的活化受体跨膜区，组合成为最适用于NK的嵌合抗原受体结构。本专利技术的第一方面，提供一种特异性活化NK细胞的嵌合抗原受体scFv-CD8hinger-NKp44TM-CD3ζ△1-2B4-DNAM1-DAP10，所述的嵌合抗原受体scFv由轻链和重链可变区构成，通过CD8铰链结构连接在NKp44跨膜区上，胞内段活化信号转导结构域由人CD3ζITAM基序、人2B4活化基序、人DNAM1活化基序与人DAP10活化基序串联构成。进一步的，所述的嵌合抗原受体包含：出膜蛋白信号肽、单链抗体轻链可变区、连接肽、单链抗体重链可变区、人CD8分子铰链区、人NKp44分子跨膜区、人CD3ζITAM序列、人2B4胞内段活化序列、人DNAM1胞内段活化序列和人DAP10YxxM活化序列。进一步的，所述的出膜蛋白信号肽分子可以使用人胰岛素信号肽(核苷酸与氨基酸序列分别如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示)、人IL-2信号肽(核苷酸与氨基酸序列分别如SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示)、人胰蛋白酶原信号肽(核苷酸与氨基酸序列分别如SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示)。在本专利技术的一个优选实施方式中，所述的出膜蛋白信号肽为人IL-2信号肽(核苷酸与氨基酸序列分别如SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示)。进一步的，单链抗体序列可以根据靶细胞不同选取针对性抗体序列。在本专利技术的一个优选实施方式中，单链抗体序列使用了针对GPC3的抗体序列。即，所述的单链抗体轻链可变区为抗GPC3单链抗体轻链可变区，对应的核苷酸与氨基酸序列分别如SEQIDNo.7和SEQIDNo.8所示；所述的单链抗体重链可变区为抗GPC3单链抗体重链可变区，对应的核苷酸与氨基酸序列分别如SEQIDNo.9和SEQIDNo.10所示。进一步的，单链抗体轻链可变区序列与单链抗体重链可变区序列之间通过柔性肽段连接，即所述的连接肽，肽段序列为(G4S)n，根据抗体的生物活性差异，n的范围为1～4。在本专利技术的一个优选实施方式中，所述的连接肽的核苷酸与氨基酸序列分别如SEQIDNo.11和SEQIDNo.12所示。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种特异性活化NK细胞的嵌合抗原受体，其特征在于，包含：出膜蛋白信号肽、单链抗体轻链可变区、连接肽、单链抗体重链可变区、人CD8分子铰链区、人NKp44分子跨膜区、人CD3ζITAM序列、人2B4胞内段活化序列、人DNAM1胞内段活化序列和人DAP10YxxM活化序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种特异性活化NK细胞的嵌合抗原受体，其特征在于，包含：出膜蛋白信号肽、单链抗体轻链可变区、连接肽、单链抗体重链可变区、人CD8分子铰链区、人NKp44分子跨膜区、人CD3ζITAM序列、人2B4胞内段活化序列、人DNAM1胞内段活化序列和人DAP10YxxM活化序列。


2.根据权利要求1所述的特异性活化NK细胞的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的出膜蛋白信号肽选自人胰岛素信号肽、人IL-2信号肽、人胰蛋白酶原信号肽。


3.根据权利要求2所述的特异性活化NK细胞的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的出膜蛋白信号肽为人IL-2信号肽，其核苷酸与氨基酸序列分别如SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示。


4.根据权利要求1所述的特异性活化NK细胞的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的单链抗体轻链可变区为抗GPC3单链抗体轻链可变区，对应的核苷酸与氨基酸序列分别如SEQIDNo.7和SEQIDNo.8所示；所述的单链抗体重链可变区为抗GPC3单链抗体重链可变区，对应的核苷酸与氨基酸序列分别如SEQIDNo.9和SEQIDNo.10所示；所述的单链抗体轻链可变区序列与单链抗体重链可变区序列之间通过柔性肽段连接，即所述的连接肽，肽段序列为(G4S)n，n的范围为1～4。


5.根据权利要求1所述的特异性活化NK细胞的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王全兴，郭猛，刘艳芳，刘芳，丁国善，曹雪涛，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：上海;31