一种曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP及其在血吸虫病免疫诊断中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP及其在血吸虫病免疫诊断中的应用。本发明专利技术的曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP，可通过基因工程技术进行大规模标准化批量生产，抗原质量稳定，结果重复性好。本发明专利技术的曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP，既可用于曼氏血吸虫病免疫诊断又可用于埃及血吸虫病免疫诊断，且具有极高的灵敏度。本发明专利技术的曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP抗原成分单一，SmSAP‑ELISA对血吸虫病免疫诊断具有极好的特异度，且不与其他寄生虫病患者血清发生交叉反应，应用前景广阔。

A recombinant fusion protein of Schistosoma mansoni, smsap, and its application in immunodiagnosis of schistosomiasis

【技术实现步骤摘要】
一种曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP及其在血吸虫病免疫诊断中的应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP及其在血吸虫病免疫诊断中的应用。
技术介绍
血吸虫病是一种严重威胁人类健康的传染性寄生虫疾病，主要流行于亚非拉的76个国家和地区，全球血吸虫感染人数超2亿人。寄生于人体的血吸虫主要有6种，包括日本血吸虫、曼氏血吸虫、埃及血吸虫、间插血吸虫、湄公血吸虫和马来血吸虫，其中以日本血吸虫、曼氏血吸虫和埃及血吸虫引起的血吸虫病流行范围最广其危害最大。日本血吸虫病主要流行于我国长江流域及东南亚等国家，曼氏血吸虫主要流行于非洲及南美洲等国家，埃及血吸虫主要流行于非洲及中东地区。随着经济全球化的不断推进，中非贸易和援外项目增多，出国务工和旅行人员日增加，我国输入性曼氏血吸虫病例和埃及血吸虫病例呈逐年增加趋势。目前，我国对输入性血吸虫病病例的诊断多依赖于传统的形态学检测方法。这种方法主要通过检查病人肠道组织、粪便或尿液中的血吸虫虫卵来确诊疾病，不但费时费力，而且对轻度血吸虫感染病例诊断的灵敏度较低，极易漏检轻度感染血吸虫病人。相比于形态学诊断方法，免疫学诊断方法具有操作简便快捷和灵敏度高等优点。但是，目前用于血吸虫病免疫学诊断的最常用的抗原是血吸虫虫体混合抗原组分，例如虫卵可溶抗原，成虫可溶抗原等，由于这种粗提抗原的成分复杂，容易与其他寄生虫病人血清发生交叉反应，导致该类血吸虫病诊断方法的特异性不足，且生产的试剂不宜标准化。依靠基因工程技术生产的血吸虫重组抗原具有成分单一、交叉反应少、可大规模批量生产等优点，被认为是理想的血吸虫病诊断抗原分子。近几年，我国科学家报道了多个日本血吸虫病免疫诊断抗原，例如SjSP-13、SjSAPLP4和SjSAPLP5抗原，以该类抗原建立的酶联免疫吸附试验(Enzyme-linkedimmunesorbentassay，ELISA)诊断方法对日本血吸虫病诊断具有极高的灵敏度和特异度。但是，由于日本血吸虫蛋白与曼氏血吸虫同源蛋白的序列同存在较大差异，因此已有的日本血吸虫病免疫诊断方法不能完全满足曼氏血吸虫病免疫诊断需求。曼氏血吸虫基因组的破译为血吸虫病防治的研究提供了空前丰富的信息资源和平台。本专利技术利用生物信息学方法对曼氏血吸虫全基因组编码基因预测分析发现曼氏血吸虫基因组中存在一个鞘脂激活蛋白样蛋白(SchistosomamansoniSaposin-likeprotein，SmSAP)基因家族，其编码蛋白中含有一个或多个SapB保守功能结构域。本专利技术利用基因合成方法将其中两个SmSAP基因进行基因融合并构建重组融合蛋白表达载体，并利用原核表达系统进行重组蛋白制备，ELISA试验确认所得重组融合蛋白用于曼氏血吸虫病和埃及血吸虫病的免疫诊断具有高灵敏度和特异度，是潜在的输入性血吸虫病免疫诊断抗原候选靶标，从而完成了本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP及其制备方法，本专利技术的另一目的是提供曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP在血吸虫病免疫诊断中的应用，为此还提供了一种具有高灵敏度和特异度的输入性血吸虫病免疫诊断试剂盒。为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案如下：本专利技术首先提供了一种经大肠杆菌密码子优化的曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP编码基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，其编码的曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供了一种重组质粒pET28a-SmSAP，其包含上述的曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP编码基因。本专利技术还提供了一种大肠肝菌宿主细胞，其包含上述的重组质粒pET28a-SmSAP。本专利技术还提供了一种曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。具体地，上述的曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP，其由去除信号肽序列的曼氏血吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白SmSAP1和曼氏血吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白SmSAP2组成，SmSAP1蛋白和SmSAP2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示。本专利技术还提供了上述的曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP在输入性血吸虫病免疫诊断中的应用。具体提供了一种血吸虫病SmSAP-ELISA免疫诊断试剂盒，其包被抗原为上述的曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP。与现有技术相比，本专利技术的技术效果：本专利技术的曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP，可通过基因工程技术进行大规模标准化批量生产，抗原质量稳定，结果重复性好。本专利技术的曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP，既可用于曼氏血吸虫病免疫诊断又可用于曼氏血吸虫病免疫诊断，且具有极高的灵敏度。本专利技术的曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP，该抗原成分单一，SmSAP-ELISA对血吸虫病免疫诊断具有极好的特异度，且不与其他寄生虫病患者血清发生交叉反应。附图说明为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术实施例1构建的曼氏血吸虫pET28a-SmSAP重组质粒结构示意图。图2是本专利技术实施例2中SmSAP重组蛋白的SDS-PAGE分析结果示意图。泳道M为蛋白分子量标准、泳道1为未诱导全菌对照、泳道2为诱导后4小时全菌、泳道3为诱导后菌体裂解后上清、泳道4为诱导后菌体裂解后沉淀、泳道5为纯化的SmSAP重组蛋白。图3为本专利技术实施例3中SmSAP重组蛋白抗原与小鼠抗His标签抗体、不同血吸虫病人血清及健康人血清的Westernblotting分析结果示意图。泳道M为蛋白分子量标准、泳道1为小鼠抗His标签抗体阳性对照、泳道2为曼氏血吸虫病患人血清、泳道为3埃及血吸虫病人血清、泳道4为日本血吸虫病人血清、泳道为5健康人血清。图4为本专利技术实施例5中SmSAP-ELISA与已有研究报道的SjSAP-ELISA用于血吸虫病免疫诊断评价比较的结果示意图。其中A为SmSAP-ELISA的检测结果，B为SjSAP-ELISA的检测结果。具体实施方式本专利技术的总体技术方案如下：首先我们利用生物信息学方法对曼氏血吸虫全基因组编码的SmSAP基因进行预测，然后利用基因合成技术制备曼氏血吸虫SmSAP融合基因，并克隆至表达质粒载体pET-28a(+)构建成曼氏血吸虫SmSAP融合基因原核表达的重组质粒pET28a-SmSAP，通过转化筛选，质粒测序鉴定确认后，转化至大肠肝菌宿主细胞中进行SmSAP重组融合蛋白诱导表达；包涵体蛋白经变性和镍柱亲和层析纯化，最终制备获得SmSAP重组融合蛋白。我们利用Westernblotting技术验证了制备的SmSAP重组融合蛋白可被曼氏血吸虫病和埃及血吸虫病患者血清抗体免疫识别。进而，我们以纯化的SmSAP重组融合蛋白为免疫诊断本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种经大肠杆菌密码子优化的曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，其编码的曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种经大肠杆菌密码子优化的曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP编码基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，其编码的曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.一种重组质粒pET28a-SmSAP，其包含权利要求1所述的曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP编码基因。


3.一种大肠肝菌宿主细胞，其包含权利要求2所述的重组质粒pET28a-SmSAP。


4.一种曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
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【专利技术属性】
技术研发人员：刘帅，陈启军，侯楠，朴贤玉，
申请(专利权)人：中国医学科学院病原生物学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11