本发明专利技术公开了一种TCRγδ为靶点的嵌合抗原受体及其应用，从N端到C端顺次拼接信号肽、单链抗体ScFv、Strep tag Ⅱ、CD8 hinge、CD28跨膜区、CD28胞内结构域、4‑1BB和CD3ζ链，所述单链抗体ScFv能够识别肿瘤细胞表面的TCRγδ。该TCRγδ为靶点的嵌合抗原受体用于修饰免疫细胞，修饰后的免疫细胞能有效地杀伤任何表面表达TCRγδ的肿瘤细胞。
Chimeric antigen receptor targeting TCR \u03b3 \u03b4 and its application
【技术实现步骤摘要】
TCRγδ为靶点的嵌合抗原受体及其应用
本专利技术涉及医药生物领域，具体是指一种以TCRγδ为靶点治疗γδT细胞淋巴瘤/白血病的嵌合抗原受体(CAR)及其应用。
技术介绍
CAR-T细胞疗法成为近年来最为火热和有效的肿瘤治疗手段之一，CAR-T细胞全称为嵌合抗原受体T细胞(ChimericAntigenReceptorT-Cell),原理为通过基因工程的方法，将能识别某种肿瘤抗原的抗体单链可变区(Scfv)与CD3ζ链的胞内区在体外偶联为一个嵌合蛋白，通过基因转导的方法转染体外培养的患者T细胞，使其表达嵌合抗体受体(CAR)。患者的T细胞被“重编程”后，生成大量具有杀伤性的CAR-T细胞，能够特异性的靶向肿瘤细胞。CAR-T与传统的免疫疗法相比，具有治疗更精确、靶向更精准、杀瘤更广泛、效果更持久等显著优势。T淋巴母细胞淋巴瘤/白血病(T-LBL/ALL)是高度恶性且复发率侵袭性淋巴瘤，主要高发于男性群体，在小儿和成人非霍奇金淋巴瘤中分别占30％和2％左右。依据T细胞抗原受体(TCR)类型差异，通常将成熟的T细胞分为γδT细胞亚型和αβT细胞亚型。在T细胞淋巴瘤/白血病中，一些特定的肿瘤细胞起源于γδT细胞，因此肿瘤细胞表面均会强表达TCRγδ，例如皮肤γδT细胞淋巴瘤，肝脾T淋巴细胞瘤及一部分外周T细胞淋巴瘤，亲上皮性肠道T淋巴细胞瘤等淋巴瘤疾病。γδT细胞淋巴瘤在临床上面临着没有特定药物靶点从而导致治疗效果差，复发率高和死亡率高等现象。然而，并未见以TCRγδ为靶点有效治疗肿瘤方法。因此，寻找合适的γδT细胞淋巴瘤特异性靶点有助于临床上改善该类肿瘤的治疗。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供一种以TCRγδ为靶点治疗γδT细胞淋巴瘤/白血病的嵌合抗原受体(CAR)，携带广谱性识别各亚型TCRγδ的ScFv序列的CAR-T细胞可以有效的杀伤任何表面表达TCRγδ的肿瘤细胞。本专利技术提供一种嵌合型抗原受体，从N端到C端顺次拼接信号肽、单链抗体ScFv、StreptagⅡ、CD8hinge、CD28跨膜区、胞内结构域，胞内结构域包括胞内信号刺激域，所述单链抗体ScFv识别并结合肿瘤细胞表面的TCRγδ。进一步地，嵌合型抗原受体的胞内结构域还包括共刺激结构域，共刺激结构域选自CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83中的一种或多种，优选为CD28和4-1BB；所述胞内信号刺激域选自CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD8、FcγRI-γ、FcγRIII-γ、FcεRIβ、FcεRIγ、DAP10、DAP12、CD32、CD79a，优选为CD3ζ。在本专利技术的一些实施例中，嵌合型抗原受体的单链抗体ScFv由重链可变区VH、连接多肽Linker、轻链可变区VL组成；优选地，所述重链可变区VH的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，所述轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，优选地，所述重链可变区VH的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，所述轻链可变区VL的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。在本专利技术的另一些实施例中，嵌合型抗原受体的嵌合型抗原受体的单链抗体ScFv由重链可变区VH、连接多肽Linker、轻链可变区VL组成；优选地，所述重链可变区VH的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示，所述轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示，优选地，所述重链可变区VH的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示，所述轻链可变区VL的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示。在本专利技术的另一些实施例中，嵌合型抗原受体从N端到C端顺次再拼接F2A、IL-7、F2A、CCL19，优选地，所述F2A的氨基酸序列如SEQIDNO.15所示，所述IL-7的氨基酸序列如SEQIDNO.16所示，所述CCL19的氨基酸序列如SEQIDNO.17所示，更优选地，所述F2A的核苷酸序列如SEQIDNO.18所示，所述IL-7的核苷酸序列如SEQIDNO.19所示，所述CCL19的核苷酸序列如SEQIDNO.20所示。胞内结构域还包括共刺激结构域，共刺激结构域为CD28和4-1BB，胞内信号刺激域为CD3ζ。更优选地，嵌合型抗原受体，从N端到C端顺次拼接信号肽、单链抗体ScFv、StreptagⅡ、CD8hinge、CD28跨膜区、共刺激结构域CD28、4-1BB、胞内信号刺激域CD3ζ、F2A、IL-7、F2A、CCL19。其中，单链抗体ScFv的重链可变区VH的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，轻链可变区VL的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术的第二目的是提供一种重组嵌合型抗原受体的基因载体，以慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、转座子载体或非病毒瞬时表达载体为骨架，插入上述的嵌合型抗原受体核苷酸序列；优选地，以病毒载体PTK881-EF1α为骨架，插入上述的嵌合型抗原受体核苷酸序列。本专利技术的第三目的是提供一种表达嵌合型抗原受体的免疫细胞，由上述的嵌合型抗原受体的核苷酸序列或上述的重组嵌合型抗原受体基因载体转染免疫细胞得到，免疫细胞选自脐带血、外周血或IPSC来源的T细胞、NK细胞、NKT细胞、αβT细胞、CD4+T细胞，CD8+T细胞，优选为外周血来源的αβT细胞；嵌合型抗原受体的单链抗体ScFv结合肿瘤表面的TCRγδ；优选地，CRISPR、RNA干扰技术联合嵌合型抗原受体原件的表达。本专利技术的第四目的是提供上述表达嵌合型抗原受体的核苷酸序列、上述的重组嵌合型抗原受体基因载体、上述的表达嵌合型抗原受体免疫细胞的用途，包括制备治疗、预防、诊断肿瘤的药物或试剂盒，优选地，所述肿瘤为γδT细胞淋巴白血病。本专利技术的第五目的是提供上述表达嵌合型抗原受体的免疫细胞的联用，包括：1)与抗肿瘤药物、抗体和/或溶瘤病毒的联用，所述抗肿瘤药物选自糖皮质激素、阿糖胞苷、顺铂、柔红霉素、阿霉素、去甲氧柔红霉素、米托蒽醌、Rapamycin、利妥昔单抗、伊马替尼、来那度胺、沙利度胺、硼替佐米、地塞米松、波尼松龙、阿糖胞苷、环磷酰胺、6-巯基嘌呤、左旋门冬酰胺酶、甲氨碟呤、长春新碱、达沙替尼中的一种或多种，优选地，权利要求3所述的嵌合型抗原受体转化T细胞得到的表达嵌合型抗原受体的免疫细胞与糖皮质激素联用；所述抗体选自PD-1、PD-L1、TIM-3、CTLA-4抗体，所述溶瘤病毒选自呼肠孤病毒、腺病毒、单纯性孢疹病毒、水泡型口炎病毒、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒；2)其他靶标联合TCRγδ的双靶或多靶标表达嵌合型抗原受体的免疫细胞，所述其他靶标选自BCMA、HER2、MUC1、EGFR、EGFRvIII、Mesothelin、FAP、B7H3、CS-1、CD19、CD7、CD4、CD8、CD3、CD5、TCRαβ、CD1a。本专利技术的有益效果在于：1、本专利技术提供的TCRγδ为靶点的嵌合抗原受体包括特定的单链抗体ScFv，其用于修饰免疫细胞，修饰后的免疫细本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种嵌合型抗原受体，其特征在于，从N端到C端顺次拼接信号肽、识别并结合肿瘤细胞表面TCRγδ的单链抗体ScFv、Strep tagⅡ、CD8 hinge、CD28跨膜区、胞内结构域，所述胞内结构域包括胞内信号刺激域。/n
【技术特征摘要】
1.一种嵌合型抗原受体，其特征在于，从N端到C端顺次拼接信号肽、识别并结合肿瘤细胞表面TCRγδ的单链抗体ScFv、StreptagⅡ、CD8hinge、CD28跨膜区、胞内结构域，所述胞内结构域包括胞内信号刺激域。
2.根据权利要求1所述的嵌合型抗原受体，其特征在于，所述胞内结构域还包括共刺激结构域，所述共刺激结构域选自CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83中的一种或多种，优选为CD28和4-1BB；所述胞内信号刺激域选自CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD8、FcγRI-γ、FcγRIII-γ、FcεRIβ、FcεRIγ、DAP10、DAP12、CD32、CD79a中的一种，优选为CD3ζ。
3.根据权利要求1所述的嵌合型抗原受体，其特征在于，所述单链抗体ScFv由重链可变区VH、连接多肽Linker、轻链可变区VL组成；优选地，所述重链可变区VH的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，所述轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，优选地，所述重链可变区VH的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，所述轻链可变区VL的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。
4.根据权利要求1所述的嵌合型抗原受体，其特征在于，所述单链抗体ScFv由重链可变区VH、连接多肽Linker、轻链可变区VL组成；优选地，所述重链可变区VH的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示，所述轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示，优选地，所述重链可变区VH的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示，所述轻链可变区VL的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示。
5.根据权利要求1所述的嵌合型抗原受体，其特征在于，从N端到C端顺次再拼接F2A、IL-7、F2A、CCL19，优选地，所述F2A的氨基酸序列如SEQIDNO.15所示，所述IL-7的氨基酸序列如SEQIDNO.16所示，所述CCL19的氨基酸序列如SEQIDNO.17所示，更优选地，所述F2A的核苷酸序列如SEQIDNO.18所示，所述IL-7的核苷酸序...
【专利技术属性】
技术研发人员：张同存，祝海川，张子健，
申请(专利权)人：武汉波睿达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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