一种包含EB病毒膜表面糖蛋白gp350优势表位肽的嵌合颗粒及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种包含EB病毒膜表面糖蛋白gp350优势表位肽的嵌合颗粒及其编码基因和应用。本发明专利技术首次发现对多个优势表位按照一定的顺序组合后再进行颗粒化展示，可以显著地提高多肽表位的免疫原性，通过免疫小鼠表明所诱导血清的总抗滴度、血清中中和抗体的滴度以及血清在细胞水平阻断病毒感染的效率都获得了显著地提高。本发明专利技术提供了一种可用于研发预防EB病毒感染的候选疫苗形式，对于预防EB病毒相关疾病具有重要的现实及理论意义和应用前景。

A chimeric particle containing the dominant epitope peptide of glycoprotein gp350 on the membrane surface of EBV and its coding gene and Application

【技术实现步骤摘要】
一种包含EB病毒膜表面糖蛋白gp350优势表位肽的嵌合颗粒及其编码基因和应用
本专利技术涉及基因工程
，具体地，涉及一种包含EB病毒膜表面糖蛋白gp350优势表位肽的嵌合颗粒及其编码基因和应用。
技术介绍
EB病毒在全球人群中广泛感染，据报道约有90％的成年人感染过EBV。在青少年时期感染EBV容易引发单核细胞增多症，一般可以自愈；感染过EBV的人群一般为病毒终身携带者。EB病毒是第一种被证实感染后可诱发肿瘤的病毒，越来越多的证据表明EB病毒与多种淋巴肿瘤(包括霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、NK/T细胞淋巴瘤等)和上皮肿瘤(包括鼻咽癌、胃癌等)的发生发展有着密切的关系，但是截至目前为止针对EBV所诱发的癌症等疾病尚未有好的治疗手段，而且市面上也没有有效的针对EB病毒感染的预防性疫苗可用，因此研发预防EBV感染的疫苗尤为重要。gp350是EBV表达的包膜糖蛋白，通过与CD21(CR2)的结合，使EBV得以进入CD21+细胞，并因在体内及体外有广泛的生物活性而受到关注。通过设计重组多表位嵌合肽(chimericpeptide，CP)及其编码基因，构建重组表达载体并在生物体内进行表达，可为预防EBV感染的疫苗设计提供新思路。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种包含EB病毒膜表面糖蛋白gp350优势表位肽的嵌合颗粒，其在制备EB病毒预防性疫苗方面具有很好的应用潜力，对于EB病毒感染的预防具有重要的现实和理论意义。本专利技术的另一目的在于提供一种编码上述嵌合颗粒的基因。本专利技术的另一目的在于提供一种含有上述基因的重组载体。本专利技术的另一目的在于提供一种含有上述重组载体的重组宿主菌。本专利技术的另一目的在于提供上述嵌合颗粒在制备EB病毒预防性疫苗中的应用。本专利技术的另一目的在于提供上述基因、重组载体和/或重组宿主菌在制备EB病毒预防性疫苗中的应用。本专利技术的另一目的在于提供一种预防EB病毒感染的疫苗制剂。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下方案予以实现的：本专利技术通过研究发现，EB病毒膜表面糖蛋白gp350的优势表位肽经过颗粒化展示后，在小鼠体内的免疫原性得到了显著地提高，检测结果表明嵌合颗粒所诱导的小鼠血清总滴度、血清特异性中和抗体滴度以及血清的体外中和阻断效率均显著高于单体形式的对照蛋白，具有成为或制备EB病毒预防性疫苗的潜力，对于EB病毒相关疾病的预防具有重要的现实和理论意义及应用前景。因此，本专利技术请求保护一种包含EB病毒膜表面糖蛋白gp350优势表位肽的嵌合颗粒，所述嵌合颗粒的氨基酸序列为SEQID:1～SEQID:5中的任意一条。其中，嵌合颗粒(即融合蛋白)149-3A的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示；149-3B的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示；149-3C的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示；149-3D的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示；149-3E的氨基酸序列如SEQIDNO:5所示。本专利技术还请求保护一种编码上述嵌合颗粒的基因，所述基因的核苷酸序列为SEQID:6～SEQID:10中的任意一条。其中，融合蛋白149-3A的编码基因核苷酸序列如SEQIDNO:6所示；149-3B的编码基因核苷酸序列如SEQIDNO:7所示；149-3C的编码基因核苷酸序列如SEQIDNO:8所示；149-3D的编码基因核苷酸序列如SEQIDNO:9所示；149-3E的编码基因核苷酸序列如SEQIDNO:10所示。本专利技术还请求保护一种重组载体，所述重组载体含有上述基因的核苷酸序列。本专利技术还请求保护一种重组宿主菌，所述重组宿主菌含有上述重组载体。本专利技术还请求保护所述嵌合颗粒在制备EB病毒预防性疫苗中的应用。本专利技术还请求保护所述基因、重组载体和/或重组宿主菌在制备EB病毒预防性疫苗中的应用。本专利技术还请求保护一种预防EB病毒感染的疫苗制剂，所述疫苗制剂包含上述嵌合颗粒以及药学上可接受的载体。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术首次发现，将EB病毒膜表面糖蛋白的多个优势表位按照一定的顺序组合后再进行颗粒化展示，其在小鼠体内的免疫原性获得了显著性提高，并且免疫小鼠血清的总抗体滴度、血清中特异性中和抗体滴度以及血清在细胞水平的阻断病毒感染效率均显著高于用作对照的非颗粒化单体糖蛋白。本专利技术提供了一种可用于研发预防EB病毒感染的候选免疫原形式，对于预防EB病毒相关疾病具有重要的现实及理论意义和应用前景。附图说明图1为重组蛋白构建示意图。图2为重组蛋白表达纯化后的SDS-PAGE分析结果。图3为重组蛋白的免疫反应性验证结果。图4为重组蛋白的颗粒性。图5为重组蛋白的免疫原性。图6为小鼠免疫血清与72A1的体外竞争活性。图7为小鼠免疫血清在细胞水平阻断病毒感染的效率。具体实施方式下面结合说明书附图及具体实施例对本专利技术作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例1重组表达载体的构建及融合蛋白的表达1、实验材料(1)本专利技术选用乙肝核心蛋白HBc149作为颗粒化展示载体，对载体进行改造，将HBc14979-81位氨基酸替换为“GGGGSGGGGTGSEFGGGGSGGGGS”并引入BamHI和EcoRI双酶切位点(GS/EF)，方便后续表位通过酶切连接的方法插入构建重组表达载体。(2)试剂与耗材：均为市购常用试剂与耗材。(3)宿主菌体：BL21DE3。2、步骤(1)为了充分考察优势表位诱导体液免疫应答的能力，对所选的gp350优势表位肽进行了随机地组合，将其插入到颗粒化载体中，构建表达载体；(2)将上述载体转化至大肠杆菌BL21DE3表达菌株中，并通过抗性筛选鉴定阳性转化子菌；(3)将阳性转化菌扩大培养后利用化学诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达；(4)收集菌体，通过超声破菌收集表达上清，然后通过热沉淀和饱和硫酸铵沉淀获得纯度在85％以上的粗蛋白，最后通过分子筛层析对粗纯蛋白进行精细纯化获得纯度在95％以上的目的蛋白，目的蛋白的纯度经过SDS-PAGE验证，测定浓度后分装冻存于-80度备用。其中，所述gp350优势表位肽氨基酸序列、优势表位肽不同组合之间的柔性Linker氨基酸序列、颗粒化展示载体氨基酸序列如下表1所示。表1氨基酸序列表所述gp350优势表位肽的编码基因核苷酸序列、优势表位肽不同组合之间的柔性Linker的编码基因核苷酸序列、颗粒化展示载体的编码基因核苷酸序列如下表2所示。表2核苷酸序列表因此，所得优势表位肽的组合可以为：I-L-I本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种包含EB病毒膜表面糖蛋白gp350优势表位肽的嵌合颗粒，其特征在于，所述嵌合颗粒的氨基酸序列为SEQ ID:1～SEQ ID:5中的任意一条。/n

【技术特征摘要】
1.一种包含EB病毒膜表面糖蛋白gp350优势表位肽的嵌合颗粒，其特征在于，所述嵌合颗粒的氨基酸序列为SEQID:1～SEQID:5中的任意一条。


2.一种编码权利要求1所述嵌合颗粒的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列为SEQID:6～SEQID:10中的任意一条。


3.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求2所述基因的核苷酸序列。


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【专利技术属性】
技术研发人员：张晓，曾益新，曾木圣，赵炳春，徐淼，冯启胜，
申请(专利权)人：中山大学肿瘤防治中心中山大学附属肿瘤医院，中山大学肿瘤研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44