一种兼有IgG结合活性及生物素结合活性的双功能蛋白及其免疫PCR试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种兼有IgG结合活性及生物素结合活性的双功能蛋白及其免疫PCR试剂盒，其特征在于：具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。本发明专利技术公开的重组蛋白，融合蛋白G‑SA可高效、高密度的捕获目标分子，达到快速、高灵敏的检测，同时可以广谱结合包括人及多种动物总IgG及不同亚类的IgG，与现有技术中的免疫球蛋白结合分子相比，它结合力也比现有的免疫球蛋白结合分子高。

A bifunctional protein with IgG binding activity and biotin binding activity and its immunopcr Kit

【技术实现步骤摘要】
一种兼有IgG结合活性及生物素结合活性的双功能蛋白及其免疫PCR试剂盒
本专利技术涉及免疫检测领域，特别涉及一种兼有IgG结合活性及生物素结合活性的双功能蛋白G-SA，及其免疫PCR试剂盒。
技术介绍
链球菌蛋白G是一种能够和多种哺乳动物的IgG以及人血清白蛋白(HSA)相结合的蛋白质，SPG同IgG的亲和力强，结合谱广。研究表明，SPG的三个同源的氨基酸序列C1、C2和C3区域与抗体IgGFc端的结合相关，并且C3区与抗体IgG的结合能力相当于C1区的7倍（Kobatake，1990）。而SPG的A、B区则具有与抗体Fab段结合以及与血清白蛋白结合的活性，被认为会起到干扰抗体与抗原的作用以及带来非特异性反应的问题。链霉亲和素（streptavidin，SA）是由链霉菌Streptomycesavidinii分泌的一种四聚体蛋白，与亲和素(avidin，AV)有相似生物学特性。SA可高度特异性地与生物素结合，一分子链霉亲和素可以与四分子生物素结合，形成生物素-链霉亲和素系统。该系统被认为是最稳定的非共价相互作用之一，并在生物
具有广泛的应用，如分子标记、分子定位和靶向药物递送。日本血吸虫病是我国一种分布广泛、危害严重的人兽共患寄生虫病，它的感染问题已经受到世界各国的普遍关注，血吸虫病诊断在血吸虫病防治工作中起到重要作用。目前血吸虫病的确诊仍是依据粪检虫卵或毛蚴，但该法缺乏灵敏性，虫卵计数也因人而异，且对轻度感染的血吸虫病人和晚期血吸虫病及经过有效防治的疫区感染人群的诊断效果并不理想，常会出现漏诊。目前，应用免疫学方法诊断病人日趋广泛，然而迄今已建立的免疫学检测系统虽有较高的敏感性与特异性，但对病人的早期诊断及疗效考核仍无理想的有效方法。因此建立一种快速、灵敏、特异的检测手段，对日本血吸虫感染的诊断尤为重要。已有研究表明，IBPs被广泛用作免疫化学试剂用来鉴定与纯化抗体、在免疫测定与酶联免疫吸附测定系统中可作为加强反应物、作为融合附加物方便重组蛋白质的固定与纯化，并且IBPs还被用于临床上体外免疫吸附，已成为非常有价值的诊断、治疗及制备的工具。但是现有的IBPs的广谱性和结合力仍然不高，并且生产成本也居高不下。而且使用用碱性磷酸酶等酶标记的酶标记G蛋白的方法存在检测灵敏度低的问题。此外，也存在热稳定性差的种类，有时会在处理中失活。无论是用碱性磷酸酶还是辣根过氧化物酶这些常用的酶标记蛋白，都面临着一套复杂的操作，例如加化学试剂进行偶联反应，纯化，透析。以此得到的产品存在蛋白失活，标记不均一等多种问题。
技术实现思路
本专利技术主要解决的技术问题是提供一种快速、高灵敏的免疫检测产品及方法，实现高效、高密度的免疫检测。本专利技术将具有与多物种IgG结合的G蛋白与链霉亲和素进行重构，形成一种新型的双性分子，既具有与IgG结合的活性，又具有与生物素的结合活性，这样获得的重组蛋白纯度高，质量稳定，与现有的商品化的生物素标记酶配套，既实现了与抗体的结合，又结合生物素标记的酶，实现了抗体标记。由于引入了生物素标记的DNA，可通过PCR进一步放大信号，比单纯的标记G蛋白标记酶的灵敏性更高，而且由于G蛋白与链霉亲和素本身的特点，应用的领域更广。为了实现上述技术方案，本专利技术提供一种融合蛋白，基于SPGC3区和SA的特点，将这两段基因连接起来，重构一种兼有IgG结合活性及生物素结合活性的双功能蛋白G-SA。本专利技术同时提供一种交联剂，所述交联剂为双功能蛋白G-SA，可以通过G-SA重组蛋白将生物素标记的DNA和抗体IgG联系起来。因此，可以将该重组蛋白作为交联剂，用于免疫学诊断。本专利技术同时提供一种免疫PCR体系中的交联剂，所述交联剂为双功能蛋白G-SA。本专利技术同时提供一种免疫PCR方法，该方法与ELISA技术的基本原理类似，不同点就在于ELISA是以酶作为标记物，根据酶催化底物的显色程度来反应待测抗原的含量，而免疫PCR则是以一段DNA分子作为标记物，根据PCR扩增DNA报告分子的产物量来表明检测结果。为了实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案：一种兼有IgG结合活性及生物素结合活性的双功能蛋白G-SA，包括链球菌蛋白G（SPG）片段和SA蛋白，所述链球菌蛋白G（SPG）片段为含有SPG的C3区段的序列；本专利技术同时提供一种密码子优化的序列，对SPG和SA序列进行密码子优化，拼接后蛋白表达量提高，可溶性增加。其中，链球菌蛋白G（SPG）片段和SA蛋白之间的连接序列为如SEQIDNO.8所示；所述链球菌蛋白G（SPG）片段的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；SA蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示；所述双功能蛋白G-SA的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；本专利技术同时提供一种双功能蛋白G-SA的构建方法，所述方法为：（1）根据G蛋白的C3片段的基因序列，从含有C3片段的菌液中PCR扩增出C3序列；（2）通过PCR从含有SA序列的菌液中扩增出SA序列；（3）先将扩增出的SA序列双酶切后，连接到表达载体上，经鉴定后再将C3片段双酶切后连接上去，构建重组蛋白的原核表达质粒；（4）将表达载体转入表达宿主中培养，活化至对数生长期后加入诱导表白蛋白；（5）经破碎、纯化后制得融合蛋白G-SA其中，步骤（1）中使用的引物对如SEQIDNO.1、2所示；步骤（2）中使用的引物对如SEQIDNO.3、4所示；上述方法中，融合蛋白基因的表达、纯化可采用本领域常规用于蛋白表达纯化的方法，例如将融合蛋白基因克隆入表达载体，将表达载体和/或共表达载体转入表达宿主中培养，活化至对数生长期后加入诱导表白蛋白，经破碎、纯化后得到融合蛋白。其中，本专利技术对表达载体、共表达载体、表达宿主的种类和类别不作限定，可选用本领域常规用于遗传修饰的载体和宿主，具体的，表达载体可为pET-28、pET-32、pET-15或pET-11的等，共表达载体可为pCDFDuet-1等；表达宿主可选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、棒状杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母或哺乳动物细胞。本专利技术中，克隆可通过例如链式酶聚合反应(PCR)完成。进一步的，本专利技术提供一种免疫PCR方法，其中所述方法：1.生物素标记DNA报告分子的制备；2.免疫PCR法检测；3.结果判断。其中，步骤1具体为：利用生物素标记的上游引物Ⅰ和无生物素标记的下游引物Ⅱ，通过PCR扩增出生物素化DNA作为免疫PCR的报告分子；步骤2具体为：（1）包被：（2）封闭；（3）加一抗；（4）加G-SA；（5）加生物素标记的DNA；（6）预变性；（7）PCR扩增；（8）电泳。本专利技术中，上述免疫PCR方法可用于各种形式的免疫分析，例如抗体检测、抗体筛选、抗原检测、病原检测、蛋白检测、蛋白相互作用筛查、高通量靶标蛋白检测、蛋白-核酸相互作用分析、药物筛本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种兼有IgG 结合活性及生物素结合活性的双功能蛋白G-SA，其特征在于所述双功能蛋白G-SA包括链球菌蛋白G（SPG）片段和SA蛋白，所述链球菌蛋白G（SPG）片段为含有SPG的C3区段的序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种兼有IgG结合活性及生物素结合活性的双功能蛋白G-SA，其特征在于所述双功能蛋白G-SA包括链球菌蛋白G（SPG）片段和SA蛋白，所述链球菌蛋白G（SPG）片段为含有SPG的C3区段的序列。


2.如权利要求1所述的兼有IgG结合活性及生物素结合活性的双功能蛋白G-SA；
其中，链球菌蛋白G（SPG）片段和SA蛋白之间的连接序列为如SEQIDNO.8所示；
所述链球菌蛋白G（SPG）片段的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；
SA蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。


3.如权利要求1所述的兼有IgG结合活性及生物素结合活性的双功能蛋白G-SA，所述双功能蛋白G-SA的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。


4.一种兼有IgG结合活性及生物素结合活性的双功能蛋白G-SA的表达方法，所述方法为：根据G蛋白的C3片段的基因序列，从含有C3片段的菌液中PCR扩增出C3序列；
通过PCR从含有SA序列的菌液中扩增出SA序列；
先将扩增出的SA序列双酶切后，连接到表达载体上，经鉴定后再将C3片段双酶切后连接上去，构建重组蛋白的原核表达质粒；
将所述表达载体转入表达宿主中培养，活化至...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱传刚，纪荣毅，袁娜娜，张霁月，沈元曦，林矫矫，洪炀，马以桐，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心上海分中心，
类型：发明
国别省市：上海;31