【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程，尤其涉及一株非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的制备及其在建立p30抗体阻断elisa检测方法中的应用。
技术介绍
1、非洲猪瘟(african swine fever,asf)是由非洲猪瘟病毒(african swine fevervirus,asfv)感染猪引起的一种烈性、高度接触性传染病，病死率可高达100％，是危害世界养猪业的一种重要传染病，世界动物卫生组织(oie)将其列为法定报告动物疫病。asfv低毒力株感染严重迟缓育肥猪生长，引致种猪繁殖障碍，且感染潜伏期长，临床症状早期不易觉察，可在猪群中悄无声息传播，晚期可出现关节炎、皮肤坏死等典型症状，危害严重，防控难度大。asf已成为猪场全力防控的首要疫病，亟需有效的技术方法和防控措施来控制asfv流行。
2、asfv是一种有囊膜、线性双链dna病毒，是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员。其病毒粒子结构较为复杂，由内至外分五层组成：含病毒基因组的类核(nucleoid)、内核心壳(core shell)、内膜(inner envelope)、衣壳(capsid)和外囊膜(outerenvelope)。asfv基因组全长为170-194kbp，由中央保守区和两端可变区组成，编码151-167个开放阅读框(open reading frame,orf)。通过质谱分析，在体外培养的细胞中，可以检测到94种病毒蛋白的表达。而成熟的病毒粒子，则发现多达68种病毒蛋白，其中未知功能蛋白达20多种。在众多asfv蛋白中，p30是asfv编码的一种早期
3、当前，asfv尚无有效疫苗和药物可供使用，检测技术在asfv防控中发挥着重要作用。但asfv强、弱毒感染存在明显差异：强毒感染引起急性型asf，症状明显，病程快，病毒血症水平及排毒量高；弱毒感染引起慢性型asf，临床症状不明显，潜伏期长，病毒量及排毒量低，存在间歇排毒现象。我国研制了多种asfv病原核酸检测技术，在猪场外防asfv输入、场内感染清除中发挥了关键作用。但asfv弱毒变异株的出现与流行，对asfv核酸检测技术形成挑战。弱毒变异株感染，病毒量低或间歇性排毒，使病原核酸检测存在漏检风险。但弱毒变异株感染，仍然可以刺激猪体产生显著的抗体免疫反应，且抗体水平稳定、持续时间长，在无疫苗使用的背景下，检测asfv抗体是诊断弱毒变异株感染的有效途径。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本专利技术以大肠杆菌表达纯化的p30蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体。通过筛选及亚克隆纯化，获得了一株分泌p30单克隆抗体的杂交瘤细胞株。该杂交瘤细胞株分泌的单抗，在阻断elisa检测中，阳性猪血清能高效阻断该单克隆抗体与p30蛋白结合，显示该单克隆抗体可应用于建立p30抗体阻断elisa，这将为我国asfv血清学检测技术开发提供坚实基础。此外，该株单抗可ifa检测中识别真核细胞中表达的p30蛋白，也能用于western blotting中识别p30蛋白，显示出该单抗对p30蛋白有良好的结合特性。
2、本专利技术的目的提供一株asfv p30单克隆抗体细胞株及其应用。所述的单克隆细胞株分泌的抗体，能识别真核细胞中的p30蛋白和用于western blotting检测p30蛋白，asfv阳性猪血清对该单克隆抗体与p30抗原结合具有抑制作用，能用于建立asfv抗体竞争elisa检测方法。
3、此外，本专利技术还提供了一种p30的制备方法及应用。
4、此外，本专利技术还提供了一种p30抗体阻断elisa方法。
5、为了解决上述技术问题，本专利技术通过如下技术方案实现:
6、本专利技术将p30蛋白免疫balb/c小鼠，取产生高水平抗体小鼠的脾细胞与sp2/0细胞融合，通过p30抗体elisa筛选阳性克隆杂交瘤，并通过稀释法获得纯化的杂交瘤细胞克隆。通过asfv阳性猪血清的阻断elisa检测，获得了一株能分泌与asfv阳性血清竞争性抗体的杂交瘤细胞株。
7、本专利技术中使用的p30抗体阻断elisa方法为：每孔p30蛋白包被量为20ng；0.05m碳酸盐缓冲液为包被液，4℃包被过夜；5％脱脂乳为封闭液，37℃封闭时间1h；asfv阳性血清作1:20倍稀释，37℃孵育1h；杂交瘤细胞培养上清37℃孵育1h；酶标羊抗小鼠抗体稀释度为1:1×104,37℃孵育1h；tmd室温下显色10min，建立了p30抗体间接elisa方法。
8、其中，所述的p30抗体重链为igg2b亚型，轻链为kappa亚型。
9、进一步的，本专利技术提供一株非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体，所述抗体包含：氨基酸序列分别为seq id no:11、13、15的重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3；和，氨基酸序列分别为seq id no:27、29、31的轻链可变区的cdr1、cdr2和cdr3；
10、优选地，所述的单克隆抗体包括，如seq id no:9所示的重链可变区，和/或，如seqid no:25所示的轻链可变区。
11、优选地，所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自fab、fab'、f(ab')2、fd、fv、dab、互补决定区片段。
12、进一步的，本专利技术提供一种分离的核酸分子，其包含能够编码抗体重链可变区的核酸序列，其中所述抗体包含氨基酸序列分别为seq id no:11、13、15的重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3；和，氨基酸序列分别为seq id no:27、29、31的轻链可变区的cdr1、cdr2和cdr3。
13、进一步的，本专利技术提供一种载体，其包含上述分离的核酸分子。
14、进一步的，本专利技术提供一种宿主细胞，其包含上述分离的核酸分子或的载体。
15、进一步的，本专利技术提供制备上述单克隆抗体的方法，其包括，在合适的条件下培养上述宿主细胞，和从细胞培养物中回收所述单克隆抗体。
16、有益效果
17、本专利技术以p30蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体，并通过elisa和阻断elisa筛选及亚克隆纯化，获得了一株分泌p30单克隆抗体的杂交瘤细胞株。该杂交瘤细胞株分泌的单抗，可识别真核细胞中表达的p30蛋白，也能用于western blotting中识别p30蛋白，且与asfv阳性猪血清中抗体具有高度竞争性，能用于建立p30抗体阻断elisa检测方法。本专利技术涉及的p30单克隆抗体细胞株及应用，为我国asfv检测技术开发提供坚实的物质和技术支撑。
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1.一株非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体，其特征在于所述抗体包含：氨基酸序列分别为SEQ ID NO:11、13、15的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3；和，氨基酸序列分别为SEQ IDNO:27、29、31的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3。
2.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体，所述的单克隆抗体包括，如SEQID NO:9所示的重链可变区，和/或，如SEQ ID NO:25所示的轻链可变区。
3.一种分离的核酸分子，其包含能够编码如权利要求1所述的一株非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的核酸序列，其中所述抗体包含氨基酸序列分别为SEQ ID NO:11、13、15的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3；和，氨基酸序列分别为SEQ ID NO:27、29、31的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3。
4.一种载体，其包含权利要求3所述的分离的核酸分子。
5.一种宿主细胞，其包含权利要求3所述的分离的核酸分子或权利要求4所述的载体。
6.一种制备权利要求1所述的单克隆抗体的方法，其
7.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体在制备ASFV抗体竞争ELISA检测试剂盒中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其中使用的p30抗体阻断ELISA方法为：每孔p30蛋白包被量为20ng；0.05M碳酸盐缓冲液为包被液，4℃包被过夜；5％脱脂乳为封闭液，37℃封闭时间1h；ASFV阳性血清作1:20倍稀释，37℃孵育1h；p30蛋白单克隆抗体37℃孵育1h；酶标羊抗小鼠抗体稀释度为1:1×104,37℃孵育1h；TMD室温下显色10min，建立了p30抗体间接ELISA方法。
...【技术特征摘要】
1.一株非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体，其特征在于所述抗体包含：氨基酸序列分别为seq id no:11、13、15的重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3；和，氨基酸序列分别为seq idno:27、29、31的轻链可变区的cdr1、cdr2和cdr3。
2.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体，所述的单克隆抗体包括，如seqid no:9所示的重链可变区，和/或，如seq id no:25所示的轻链可变区。
3.一种分离的核酸分子，其包含能够编码如权利要求1所述的一株非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的核酸序列，其中所述抗体包含氨基酸序列分别为seq id no:11、13、15的重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3；和，氨基酸序列分别为seq id no:27、29、31的轻链可变区的cdr1、cdr2和cdr3。
4.一种载体，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑浩，李佳佳，童光志，闫婉婉，单同领，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心上海分中心，
类型：发明
国别省市：
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