一种针对猪流行性腹泻具有免疫原性的融合蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种针对猪流行性腹泻具有免疫原性的融合蛋白及其应用，本发明专利技术的针对猪流行性腹泻病毒具有免疫原性的融合蛋白，为含有猪流行性腹泻病毒的S1D中和表位的融合蛋白，本发明专利技术还进一步公开了一种重组减毒单核细胞增生性李斯特细菌，所述重组减毒单核细胞增生性李斯特细菌为携有克隆了密码子优化的PEDV S1D编码基因的重组DNA质粒。本发明专利技术的融合蛋白或其编码基因或重组减毒单核细胞增生性李斯特细菌可用于制备猪流行性腹泻病毒疫苗。

An immunogenic fusion protein for swine epidemic diarrhea and its application

【技术实现步骤摘要】
一种针对猪流行性腹泻具有免疫原性的融合蛋白及其应用
本专利技术属于基因工程
，尤其涉及一种针对猪流行性腹泻具有免疫原性的融合蛋白及其应用。
技术介绍
猪流行性腹泻(PorcineEpidemicDiarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(PorcineEpidemicDiarrheaVirus,PEDV)引发的猪肠道性传染病。1978年比利时研究人员首次成功分离该病毒，毒株命名为CV777。PEDV主要结构蛋白包括S、N、M和E蛋白，其中，S蛋白由S1和S2两个亚基组成，S1亚基负责识别宿主细胞表面受体，也是诱导中和保护性抗体以及研制亚单位疫苗的重要靶抗原，S1D是S1亚基的中和表位之一；S2亚基负责病毒囊膜与宿主细胞膜的融合。2010年以来，PEDV引发的严重猪腹泻性疾病开始在我国广泛流行，该病毒主要感染新生仔猪，临床表现为剧烈呕吐和腹泻，7日龄内哺乳仔猪的感染死亡率高达70-80％，给我国这一养猪大国的养猪业造成极大经济损失。与经典毒株CV777相比，新的流行毒株已发生变异，特别是S1亚基的变异较大，而PEDV新流行毒株的细胞分离培养相当困难，我国目前仍主要使用经典毒株CV777所制备疫苗进行预防性接种，保护力不充分，因此，研制可表达新流行毒株中和表位抗原的活载体疫苗应是当下的策略之一。单核细胞增生性李斯特细菌(Listeriamonocytogenes,LM)是一种具广泛宿主谱的兼性胞内菌。LM被宿主的吞噬性细胞吞噬后，部分细菌能从吞噬体“逃逸”至宿主细胞的细胞质中并在细胞质中繁殖，如此，LM表达的外源抗原可同时经MHC-I类和MHC-II类途径提呈，从而诱导强烈的细胞免疫应答和体液免疫应答。LM独特的胞内寄生模式，赋予其作为疫苗载体的广阔应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种具有猪流行性腹泻免疫原性的融合蛋白及其应用。本专利技术第一方面提供了一种针对猪流行性腹泻具有免疫原性的融合蛋白，为在减毒重组单核细胞增生性李斯特细菌中分泌表达的含有PEDVS1D中和表位的融合蛋白。进一步地，所述融合蛋白具体为单核细胞增生性李斯特细菌溶血素蛋白LLO的信号肽和PEDVS1D中和表位及绿色荧光蛋白GFP的融合蛋白。所述PEDVS1D中和表位的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。所述单核细胞增生性李斯特细菌溶血素蛋白LLO信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。所述绿色荧光蛋白GFP的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。所述减毒重组单核细胞增生性李斯特细菌包含编码PEDVS1D中和表位的多核苷酸，所述编码PEDVS1D中和表位的多核苷酸SEQIDNO.7。所述融合蛋白中，密码子优化的PEDVS1D中和表位的N端与单核细胞增生性李斯特菌溶血素蛋白LLO的信号肽的C端融合，同时，密码子优化的PEDVS1D中和表位蛋白的C端与绿色荧光蛋白融合。进一步的，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。所述融合蛋白针对猪流行性腹泻具有较强的免疫原性。本专利技术第二方面提供了一种多核苷酸，其编码所述融合蛋白。本专利技术的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。进一步的，所述多核苷酸中，编码PEDVS1D中和表位的基因序列为SEQIDNO.7。所述多核苷酸可用于构建PEDVS1D中和表位的表达载体，并进一步构建表达PEDVS1D中和表位的宿主细胞。本专利技术第三方面提供了一种载体，其含有所述多核苷酸。本专利技术第四方面提供了一种宿主细胞，其被所述载体所转化。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，乳酸菌，李斯特细菌；真菌细胞如饲用酵母；植物细胞；sf9昆虫细胞；CHO，VERO，PK15细胞等。其中，特别优选单核细胞增生性李斯特细菌(Listeriamonocytogenes，LM)。本专利技术第五方面提供了一种重组减毒单核细胞增生性李斯特细菌，所述重组减毒单核细胞增生性李斯特细菌的基因组包含有PEDVS1D中和表位基因，所述PEDVS1D中和表位基因的序列为SEQIDNO.7，所述重组减毒单核细胞增生性李斯特细菌能融合表达单核细胞增生性李斯特细菌溶血素蛋白LLO的信号肽和PEDVS1D中和表位及绿色荧光蛋白GFP的融合蛋白。优选的，所述减毒单核细胞增生性李斯特细菌的血清型为1/2a。如LM-1003等。进一步的，相比野生型单核细胞增生性李斯特菌株HA-1069，本专利技术中的减毒单核细胞增生性李斯特细菌为已将野生型单核细胞增生性李斯特细菌的actA和plcB两基因同时进行了缺失的菌株。如LM-1003等。本专利技术第六方面公开了所述重组减毒单核细胞增生性李斯特细菌的构建方法，包括下列步骤：1)从单核细胞增生李斯特菌株HA-1069基因组中扩增出LLO的启动子phly2及其下游相邻的信号肽编码序列phly2(LLO)，合成PEDVS1D中和表位编码基因，从pT7-GFP质粒上扩增GFP蛋白编码基因。2)按phly2(LLO)-PEDVS1D-GFP次序拼接成融合片段并连接入穿梭质粒获得重组穿梭质粒。3)将重组穿梭质粒转化减毒单核细胞增生性李斯特细菌，得重组减毒单核细胞增生性李斯特细菌。进一步的，步骤1中从单核细胞增生李斯特菌株基因组中扩增出LLO的启动子phly2及其下游相邻的信号肽编码序列phly2(LLO)的DNA序列为SEQIDNO.6，公司合成的PEDVS1D中和表位编码基因序列为SEQIDNO.7，质粒pT7-GFP上的GFP蛋白编码基因的序列为SEQIDNO.8。进一步的，步骤1)中所述单核细胞增生性李斯特菌株的血清型为1/2a。如为单核细胞增生性李斯特菌株HA-1069等。进一步的，步骤2)可采用重叠衍生PCR技术(SOEingPCR)拼接各片段，再利用酶切位点将拼接片段插入穿梭载体中。进一步的，步骤2)中，穿梭质粒可为pKSV7。拼接成的phly2(LLO)-PEDVS1D-GFP融合片段的多核苷酸序列为SEQIDNO.9。进一步的，步骤3)中所述减毒单核细胞增生性李斯特菌株的血清型为1/2a。如为单核细胞增生性李斯特菌株LM-1003等。本专利技术第六方面，提供了所述的融合蛋白或其编码基因或所述重组减毒单核细胞增生性李斯特细菌在制备猪流行性腹泻疫苗上的用途。进一步的，所述重组细菌疫苗为针对猪流行性腹泻的预防性疫苗。本专利技术第七方面，提供了一种疫苗，包括所述融合蛋白或所述重组减毒单核细胞增生性李斯特细菌。所述疫苗中还可进一步包括佐剂。本专利技术利用单核细胞增生性李斯特细菌被吞噬性细胞吞噬后，部分细菌能从细胞吞噬体中“逃逸”出来，进入细胞质并繁殖，诱发机体产生坚强体液免疫和细胞免疫的特本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种针对猪流行性腹泻具有免疫原性的融合蛋白，为在减毒重组单核细胞增生性李斯特细菌中分泌表达的含有PEDV S1D中和表位的融合蛋白。/n

【技术特征摘要】
1.一种针对猪流行性腹泻具有免疫原性的融合蛋白，为在减毒重组单核细胞增生性李斯特细菌中分泌表达的含有PEDVS1D中和表位的融合蛋白。


2.如权利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为单核细胞增生性李斯特细菌溶血素蛋白LLO的信号肽和PEDVS1D中和表位及绿色荧光蛋白GFP的融合蛋白，PEDVS1D中和表位连接于溶血素蛋白LLO的信号肽的C端，绿色荧光蛋白GFP连接于PEDVS1D中和表位的C端。


3.如权利要求2所述融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。


4.如权利要求1-3任一所述融合蛋白，其特征在于，所述减毒重组单核细胞增生性李斯特细菌包含编码PEDVS1D中和表位的多核苷酸，所述编码PEDVS1D中和表位的多核苷酸序列为SEQIDNO.7。


5.一种多核苷酸，其编码权利要求1-4任一所述融合蛋白，所述融合蛋白中编码PEDVS1D中和表位基因序列为SEQIDNO.7。


6.一种载体，其含有权利要求5所述多核苷酸。


7.一种宿主细胞，其被权利要求6所述载体转化。


8.如权利要求7所述宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为单核细胞增生性李斯特细菌。


9.如权利要求8所述宿主细胞，其特征在于，所述单核细胞增生性李斯特细菌的血清型为1/2a。


10.一种重组减毒单核细胞增生性李斯特细菌，所述重组减毒单核细胞增生性李斯特细菌基因组中含有PEDVS1D中和表位基因，所述PEDVS1D中和表位基因的序列为SEQI...

【专利技术属性】
技术研发人员：王恒安，涂光岚，桑益旸，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31