靶向VEGF与EGFR的双功能融合蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种靶向VEGF与EGFR的双功能融合蛋白及其应用。本发明专利技术提供的融合蛋白可特异性结合表皮生长因子受体(EGFR)和血管内皮生长因子(VEGF)。本发明专利技术提供一种疗效确切、稳定性高的靶向且协同抑制EGFR/VEGF(R)通路的融合蛋白，该融合蛋白通过阻断Akt/Stat3信号通路磷酸化，从而抑制血管新生或细胞生长。具有显著的靶向成像效果和抗PDAC肿瘤的显著疗效。本发明专利技术提供的融合蛋白具有很强的靶向特异性诱导肿瘤细胞凋亡作用，可用于恶性肿瘤的治疗。

Bifunctional fusion protein targeting VEGF and EGFR and its application

【技术实现步骤摘要】
靶向VEGF与EGFR的双功能融合蛋白及其应用
本专利技术涉及基因工程和生物医药领域，具体地说，涉及一种靶向VEGF与EGFR的双功能融合蛋白及其应用。
技术介绍
胰腺导管腺癌(PDAC)是一种高恶性、侵袭性的实体肿瘤，由于其复杂的遗传异质性，早期难以发现，预后较差。迄今为止，无论是化疗、靶向药物还是免疫治疗，均未发现有效的PDAC治疗药物。尽管近年来针对PDAC的大量治疗方法得到了迅速发展，但5年生存率仍然保持在5％以下。PDAC由相当复杂的组织元素组成，其特点是组织背景致密、高压、间质血管化不良。这些内源性的特性也导致了一系列的死锁治疗，如渗透性差、令人尴尬的耐药性、快速复发和复杂的肿瘤异质性使得单一靶点难以取得良好的疗效。因此，提高胰腺癌的早期诊断率，抑制肿瘤的生长和远处转移，提高药物的治疗效果，成为改善胰腺癌患者预后的关键因素。随着对胰腺癌生物学行为的深入研究及其细胞分子学机制的掌握，应用分子靶向药物治疗胰腺癌目前已逐渐成为晚期胰腺癌治疗的研究重点。在胰腺癌中EGFR、HER2、VEGF、PDGFR、c-Kit等多种分子标志物过度表达或激活，在细胞间信号转导和调控分化、增殖、存活、迁移、血管生成等关键过程中发挥重要作用。胰腺癌细胞常伴表皮生长因子受体(EGFR)的高表达，在胰腺癌的形成、进展及转移中具有重要作用。EGFR的几个下游信号通路发挥着重要作用，包括通过MAPK通路介导增殖和通过PI3K/AKT通路存活。同时EGFR在胰腺癌中也高度保守，这些结果为靶向治疗的可行性提供了研究基础。因此，抑制EGFR的表达和下游信号通路可以诱导具有本构性磷酸化的胰腺癌细胞凋亡，从而实现包括PADC在内的抗癌策略。目前，EGFR抑制剂包括针对EGFR胞外结构域的西妥昔单抗等单抗体，以及针对EGFR胞内结构域的小分子酪氨酸激酶受体抑制剂，如厄洛替尼、吉非替尼等。但与其他肿瘤一样，针对EGFR的多种靶向药物在胰腺癌患者中的总体应答率仍不高，其机制仍不清楚。如何加强针对EGFR的靶向药物的疗效，成为亟待解决的问题。血管内皮细胞生长因子(VEGF)是控制血管新生最重要的因子，是诱导和促进血管形成作用最强、最专一的血管生长因子，在几乎所有的人体肿瘤中都过量表达，是抗癌研究的一个重要分子靶标。多项研究表明VEGF在胰腺癌血管生成中起关键作用，在64％的胰腺癌细胞中过表达。VEGF与VEGFR特异性结合，可激活内皮细胞增殖、迁移和转移，增加血管通透性。VEGF通过自分泌和旁分泌途径间接激活EGFR表达上调，与肿瘤细胞侵袭性增强有EGFR和VEGF(R)通路在许多肿瘤细胞的存活和血管生成中具有交叉作用。阻断肿瘤内新生血管的形成可以有效地阻止肿瘤的生长和引发肿瘤细胞的死亡，从而达到对肿瘤的治疗作用。因此，抑制血管新生是目前抗肿瘤新药研究的重要方向之一。如FDA已经批准上市的Avastin同时还有更多的药物处于不同的临床前和临床研究阶段。因此，联合靶向和协同抑制EGFR/VEGF(R)通路对PDAC治疗是一种很有前途的策略。现有的抗体或抗体-药物结合物在PDAC治疗的临床试验中疗效不佳，迫切需要探索更有效和个性化的策略来处理复杂的遗传异质性和独特的组织特征，实现更好的PDAC分子成像和治疗。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种靶向VEGF与EGFR的双功能融合蛋白及其应用。为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种靶向VEGF与EGFR的双功能融合蛋白，所述融合蛋白包含如下的氨基酸序列或由其组成：i)、SEQIDNO:1(可特异性结合表皮生长因子受体)和SEQIDNO:2(可特异性结合血管内皮生长因子)所示的氨基酸序列；或ii)、在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或iii)、i)或ii)的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的融合蛋白。可选地，SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的氨基酸序列之间通过柔性Linker连接。所述柔性Linker优选为GGSSRSS。本专利技术提供一种靶向VEGF与EGFR的双功能融合蛋白Bi50，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。第二方面，本专利技术提供编码所述融合蛋白的核酸分子。第三方面，本专利技术提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系等。优选地，所述表达载体是真核表达载体或病毒表达载体。第四方面，本专利技术提供一种组合物，其包含所述融合蛋白和药学上可接受的载体或赋形剂。第五方面，本专利技术提供Akt和/或Stat3信号通路抑制剂，有效成分为所述融合蛋白。第六方面，本专利技术提供胰腺癌治疗药物或组合物，有效成分为所述融合蛋白。优选地，所述药物或组合物的制剂形式可以是注射剂、注射用冻干粉针或眼用凝胶。第七方面，本专利技术提供所述融合蛋白的以下任一应用：1)用于制备抗肿瘤药物或组合物；2)用于制备肿瘤诊断试剂和/或肿瘤显像剂；3)用于肿瘤治疗和检测；4)用于肿瘤靶向载药和成像。本专利技术中，所述肿瘤包括但不限于胰腺导管腺癌。前述的应用，还包括将所述融合蛋白与其他抗肿瘤药物联合使用。第八方面，本专利技术提供一种诊断试剂盒，其包含所述融合蛋白以及任选标记物或用于偶联的试剂。优选地，所述标记物可以是荧光分子，核素或Gd-DOTA。本专利技术还提供所述融合蛋白的制备方法，所述方法包括：人工合成编码所述融合蛋白的DNA序列，将DNA序列连入表达载体，转染细胞，表达、分离纯化目的蛋白。本专利技术提供的融合蛋白的可特异性结合表皮生长因子受体(EGFR)和血管内皮生长因子(VEGF)，进而抑制血管新生或细胞生长。融合蛋白Bi50可与肿瘤细胞发生特异性结合，穿入细胞膜进入胞浆并特异性诱导肿瘤细胞凋亡，以达到靶向特异性诱导肿瘤细胞凋亡的作用，可用于恶性肿瘤的治疗。本专利技术提供一种疗效确切、稳定性高的靶向且协同抑制EGFR/VEGF(R)通路的融合蛋白，该融合蛋白通过阻断Akt/Stat3信号通路磷酸化，从而抑制血管新生或细胞生长。具有显著的靶向成像效果和抗PDAC肿瘤的显著疗效。本专利技术提供一种集靶向治疗和检测于一体的PDAC诊疗方法。本专利技术提供的全人源抗EGFR和VEGF双特异性抗体融合蛋白(靶向VEGF与EGFR的双功能融合蛋白)，与药学上可以接受的辅料一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效。在对包括人在内的动物给药后，抗肿瘤效果明显。具体来讲，对肿瘤的预防和/或治疗有效，可以作为抗肿瘤药物使用。将本专利技术的双靶向融合蛋白直接或间接地用标记合适的可检测物质，包括多种生物学活性酶、荧光分子、顺磁(如钆等磁共振活性)物质和放射性核素，用于体内和体外肿瘤检测和成像。在Bxpc3原位移植小鼠中，二维和三维MSOT图像显示了融合蛋白Bi50具有良好的瘤内积累和良好的组织穿透能力。Westernblot结果显示Bi本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.靶向VEGF与EGFR的双功能融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含如下的氨基酸序列或由其组成：/ni)、SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或/nii)、在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或/niii)、i)或ii)的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的融合蛋白。/n

【技术特征摘要】
1.靶向VEGF与EGFR的双功能融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含如下的氨基酸序列或由其组成：
i)、SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；或
ii)、在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或
iii)、i)或ii)的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的融合蛋白。


2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示氨基酸序列之间通过柔性Linker连接；
优选地，所述柔性Linker为GGSSRSS。


3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。


4.编码权利要求1-3任一项所述融合蛋白的核酸分子。

【专利技术属性】
技术研发人员：王倩，王子华，赵心明，
申请(专利权)人：中国医学科学院肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：北京;11