抗人GPC3单克隆抗体制造技术

本发明专利技术公开了一种抗人GPC3单克隆抗体，其是以人源GPC3为靶点，基于噬菌体展示技术，开发的特异性、高亲和力的纳米抗体。相对于现有技术，本发明专利技术成功制备了抗人GPC3单克隆抗体，该抗体异性好，亲合力较高，并可结合细胞表面表达的人源GPC3，该抗人GPC3单克隆抗体是肿瘤免疫治疗的潜在药物。

Monoclonal antibody against human GPC3

【技术实现步骤摘要】
抗人GPC3单克隆抗体
本专利技术涉及一种抗人GPC3单克隆抗体，属于单克隆抗体

技术介绍
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican3，GPC3)是细胞膜表面的硫酸乙酰肝素蛋白多糖，由一种核心蛋白(GPC)、硫酸乙酰肝素(HS)和糖基化磷脂酰肌醇(GPI)三部分共价连接形成的的糖-脂-蛋白复合物。HS通过寡糖链连接到GPC的丝氨酸残基上，GPC蛋白借助Asp554位点通过GPI锚定于细胞膜表面，其中因HS连接位点为GPC的C末端两个丝氨酸，使HS链靠近细胞膜。核心蛋白由580个a.a.组成，分子量约70KD，中间为furin蛋白酶切点，可被furin从Arg358和Cys359之间切开，形成40KD的N末端亚单位和30KD的C末端亚单位，N末端有分泌信号，C末端锚定于细胞膜上。GPC3分子中有三个功能域，分别为蛋白的N端、C端及两个HS糖链。GPC3可结合肝素结合型蛋白如生长因子、细胞外基质成分、细胞黏附分子和与降解通路有关的分子，调控着细胞生长、分化等行为，在机体的生长发育中起着重要作用。GPC3的功能可能与其结合生长因子有关，分子中的HS链带有负电荷，能够结合带正电的生长因子，包括肝细胞生长因子、纤维细胞生长因子。另外GPC3亦可与Wnts、Hedgehog和骨形成蛋白信号通路互作，从而影响这些信号途径的生物学功能。在胚胎发育过程中，GPC3与IGF2信号通路和互作强烈影响组织器官的分化，比如：GPC3在胚胎组织中高表达，正常成人中不表达；在胚胎性瘤和小鼠胚胎组织中，发现GPC3与IGF2共同表达，通过与IGF2信号通路的互作，影响中胚层组织和器官的发育；在特定细胞中，GPC3可导致细胞凋亡，其引起的凋亡可被IGF抑制。GPC3是在研究过度生长综合症时发现的，其功能缺失是造成过度生长和畸变综合症的原因。在巨大舌-脐膨出综合症的发生过程中，GPC3功能缺失，造成IGF2信号途径功能的过度表达，显示二者之间存在竞争与平衡。甚至有研究认为在正常发育组织中，GPC3通过竞争Hedgehog受体而产生抑制组织生长(分化)的功能。GPC3在中胚层来源组织中高表达，而在成熟组织中低表达或不表达。过表达GPC3后，肝细胞的增殖和肝再生被抑制。这些现象说明，GPC3功能主要为调控细胞生长和分化，似乎起到抑制生长的平衡者的作用，与多种信号途径存在互作，其功能复杂，其表达受到精细调控。GPC3在胎盘和胎儿组织中表达丰富,如肝、肺和肾，在正常成人器官中表达显著降低。在成人中，GPC3表达倾向于出现恶性转化的组织，如肺鳞癌和肝细胞肝癌，特别与肝癌的发生、发展密切相关。Notrhernblotting检测发现，GPC3在正常肝组织、肝脏局灶性结节增生和肝硬化中低表达或不表达，相对前三类样本，GPC3在肝细胞肝癌样本中的量增加了21.7、7.2、10.8倍。组织芯片免疫组化检测发现，GPC3在非肿瘤肝样品、癌前结节状肝样品和肝细胞肝癌样品中的检出率分别为9.2％、16％、63.6％。这些发现提示GPC3做为肝癌诊断指标具有灵敏性和特异性。GPC3高表达与低表达晚期肝癌患者对比给药发现，GPC3单抗可大大延缓高表达组肝癌肿瘤的中位进展时间。另外，GPC3单抗可抑制GPC3阳性肝细胞肝癌小鼠移植瘤的生长，而对GPC3阴性移植瘤无效。GPC3在肝癌组织中特异性高表达，并可作为肝癌靶向治疗的有效靶点，尽管与其正常情况下抑制生长的功能背道而弛。GPC3参与肝癌的发生发展与Wnt信号途径密切相关，下调β-catenin,GPC3诱导肝细胞肝癌中c-Myc的功能被阻断。其与Wnt/β-catenin信号通路的互作需要HS及GPI功能的参与，丧失HS功能后GPC3仍可与Wnt结合但细胞增殖和β-catenin转录受阻，丧失GPI锚定功能后GPC3起抑制肝癌细胞生长的功能。GPC3具有调控细胞生长、分化的重要生物学功能，与其互作的分子种类多，参与或受其影响的信号转导途径多样。从这个意义上来讲，以GPC3为靶点，可开发多种作用机制的抗体药，除了传统的单一抗体药的阻断/竞争和ADCC/CDC/ADCP机制、抗体偶联药物、疫苗和过继性免疫细胞治疗外，易于找到与其协同作用的其它靶点，从而开展联合用药或开发多特异性抗体，提高治疗效果或便利选择用药。就目前研发中的抗体而言，虽然已知的GPC3单克隆抗体都是可用的，但是没有一个可以展现出针对于肿瘤细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC)。由此可见，利用传统杂交瘤技术获得强CDC效应的靶向GPC3的抗体是一件困难的事情。比如传统方法获得的抗体组织穿透力差治疗效果不足、免疫原性强需要人源化改造、稳定性差运输和保存要求高、研发和使用费用高。总之，已有的传统抗体尽管为疾病的治疗/检测起到了极其重要的作用，但其不足之处亦很明显。针对GPC3靶点，目前临床药物有16个，其中属于中国国内研发机构的有10个，治疗的疾病以肝癌治疗为主，包括一例肺鳞癌，使用方法以CART细胞免疫疗法为主，包括一例抗体药。这16个抗体中，有些为人-鼠嵌合抗体，有些为人源抗体，均来源于小鼠，采用杂交瘤技术获得。就靶向GPC3的抗体而言，目前尚未有纳米抗体研发的公开报道，而基于噬菌体展示技术的靶向GPC3的抗体筛选方案目前亦未见公开报道。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术存在的问题，本专利技术公开了一种抗人GPC3单克隆抗体。技术方案：为了达到上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一种抗人GPC3单克隆抗体，所述抗体为单链结构，并且包括氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的抗原结合部位。作为本专利技术的一种实施方案，所述抗人GPC3单克隆抗体包括信号肽和抗原结合部位，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。或者，所述抗人GPC3单克隆抗体包括信号肽、抗原结合部位和人源Fc区域，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。或者，所述抗人GPC3单克隆抗体包括信号肽、抗原结合部位、柔性连接肽和人源Fc区域，其氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。所述的抗人GPC3单克隆抗体的制备方法，是采用噬菌体展示肽库筛选的方法。具体的方法如下：以商品化的重组人GPC3标签蛋白和噬菌体展示天然纳米抗体库为起始材料。将GPC3蛋白包被在免疫管上，用纳米抗体库与其孵育，洗去未结合/结合弱的噬菌体，将与GPC3蛋白结合的噬菌体洗脱下来。如此反复若干次，每次改变GPC3蛋白包被量和洗涤条件，逐次淘汰掉结合弱的噬菌体并尽可能保留更多的结合强的噬菌体。侵染宿主菌后涂布固体培养基平板，将获得的结合能力强的噬菌体单克隆化，利用单克隆培养上清进行ELISA筛选，并对单克隆进行核酸序列测定。建立编码序列(本专利技术一种实施方案，将分泌型荧光素酶的信号肽、纳米抗体即抗原结合部位、柔性连接肽、人源IgG2Fc和His标签的编码序列连接)，同框阅读，构建哺乳动物表达载体。转染CHO-K1细胞，取上清进行流式细胞术检测。大量转染流式测定阳性的表达载体，利用Ni-NTA亲和层析柱从上清中纯化获得融合蛋白，并对其与GPC3结合特性进行鉴定本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗人GPC3单克隆抗体，其特征在于，所述抗体为单链结构，并且包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的抗原结合部位。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗人GPC3单克隆抗体，其特征在于，所述抗体为单链结构，并且包括氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的抗原结合部位。


2.根据权利要求1所述的抗人GPC3单克隆抗体，其特征在于，所述抗人GPC3单克隆抗体包括信号肽和抗原结合部位，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。


3.根据权利要求1所述的抗人GPC3单克隆抗体，其特征在于，所述抗人GPC3单克隆抗体包括信号肽、抗原结合部位和人源Fc区域，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。


4.根据权利要求1所述的抗人GPC3单克隆抗体，其特征在于，所述抗人GPC3单克隆抗体包括信号肽、抗原结合部位、柔性连接肽和人源Fc区域...

【专利技术属性】
技术研发人员：张军锋，郭志刚，
申请(专利权)人：南京蓝盾生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32