靶向GPC3的抗体-药物偶联物及其制备方法和用途技术

本发明专利技术描述了抗磷脂酰肌醇聚糖蛋白3(GPC3)的抗体药物偶联体，所采用的通过一类新型双取代马来酰亚胺连接子将强细胞毒活性物质和生物大分子进行偶联。该类连接子可选择性与二硫链同时作用，从而大大提高偶联物的物质均一性。本发明专利技术的连接子所制备的偶联物对于表达GPC3抗原的细胞株具有高抑制活性。此外，本发明专利技术还提供了上述偶联物的制备方法和用途。

Antibody drug conjugate targeting GPC3 and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
靶向GPC3的抗体-药物偶联物及其制备方法和用途
本专利技术涉及药物领域，更具体地，涉及靶向于磷脂酰肌醇聚糖蛋白3(GPC3)的抗体-药物偶联物的及其制备方法和用途。
技术介绍
肝细胞癌(HCC)是世界第五大最常见癌症和第三大最常见癌症死亡原因。根据美国癌症学会，肝细胞癌(HCC)占肝癌病例的约75％，往往直到晚期肝癌才会有症状。目前，手术是HCC最有效的治疗方法。然而，根治性肝脏切除术后肿瘤的复发率很高，5年生存率只有10％。此外，因为大多数的HCC患者是在疾病后期阶段才被诊断，因此根治性治疗，包括化疗、化疗栓塞、切除和质子束疗法，通常可能是无效的。索拉非尼(Nexavar)，是第一种临床批准的HCC靶向药物，只能使总生存期延长2-3个月。肝癌在世界上最流行的肿瘤中位居第五并且在癌症相关死亡的最常见原因中位居第三。外科手术是肝癌的标准治疗，因为这种类型的癌症对大多数的化疗药物反应不好。因此，迫切需要开发具有不同作用机制的新药物。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)是硫酸乙酰肝素(HS)蛋白聚糖glypican家族的一员，可通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚，附着在细胞表面。GPC3在细胞生长、分化和迁移过程中发挥重要的作用。有多项研究表明，GPC3在许多人类恶性肿瘤细胞和血清中表达。GPC3是一种有吸引力的肝癌特异性靶标，因为它在HCC中高表达，但是在正常组织中表达有限。GPC3已经显示出在超过70％的肝细胞癌活组织检查切片中高表达，但在邻近的非肿瘤组织中不表达。GPC3阳性HCC患者的无病存活率显著低于GPC3阴性HCC患者。随着对GPC-3与恶性肿瘤形成机制研究的深入，研究人员还发现其在多种恶性肿瘤，如肺鳞癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌、神经母细胞瘤、Wilm肉瘤、脂肪肉瘤、睾丸非精原细胞瘤、卵巢癌、黑素瘤等肿瘤中过表达。抗体-药物偶联物，是利用单克隆抗体特异性识别肿瘤细胞表面特定抗原的特点，从而实现精准地将抗肿瘤药物(如细胞毒剂或细胞抑制剂，小分子化疗物等)递送到肿瘤靶细胞，发生胞内积蓄并释放，达到精准杀伤肿瘤的目的。ADC也因为其分子量大小合适，稳定性高，靶向性强，毒副作用小被认为是最具潜力的抗肿瘤药物。但成功开发ADC也存在诸多必须考虑且必须解决的问题，如抗体要特异性的识别病变部位，免疫致敏性低，能够高效迅速的发生细胞内吞作用；抗体-药物接头，在血液中稳定性要高并能在靶向细胞中特异的被激活并高效释放小分子药物(否则会对正常细胞产生了不可接受水平的毒性)；所偶联的小分子药物细胞杀伤能力要强等。抗体药物偶联物一般由三部分组成：抗体或抗体类配体，小分子药物，和将配体与药物偶联起来的连接子。目前进入临床试验的抗体药物偶联物结构中，高活性的细胞毒性药物通常是通过连接子连接在配体表面的赖氨酸残基，或者抗体铰链区域的半胱氨酸残基(由链间二硫键部分还原得到)上,最佳的药物/配体比值(DAR)为2-4。抗体表面大量的赖氨酸残基(超过80个)以及偶联反应的非选择性，导致偶联数目和位点的不确定性，进而导致生成的抗体药物偶联物的不均一性。例如，T-DM1(平均DAR值为3.5)的DAR值分布为0-8。同样，尽管抗体铰链区的链间二硫键只有四对，但为达到最佳平均DAR值(2-4)的要求，需要部分还原链间二硫键。由于现有的还原剂(DTT,TCEP等)无法选择性地还原链间二硫键，因此生成的偶联物也不是均一的产物，由多种组分组成，其主要组分的DAR值为0、2、4、6、8，而且对应每一种特定DAR值的组分都存在由于连接位点不同而形成的异构体。抗体药物偶联物产品的不均一性可以导致各成员组分间药物动力学性质，效价以及毒性的不均一性。例如，具有较高DAR值的组分在体内被清除得更快，并导致更高的毒性。针对以上偶联技术存在的问题，通过简单的化学方法对现有抗体实现定点偶联目的，会节省大量的资源，因此更加富有吸引力。然而现有技术中的方法大多存在偶联试剂合成路线较长、偶联试剂化学稳定性不佳、抗体偶联物电泳图较为杂乱，提示偶联过程中可能存在副反应、现有方案并未解决体内循环过程中的巯基交换(逆迈克尔加成反应)等问题。因此，本领域迫切需要提供高效、简单、实用的化学偶联方法用于靶向GPC3的抗体-药物偶联物研究与开发。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种靶向磷脂酰肌醇聚糖蛋白3(GPC3)的抗体、其制备方法和用途。本专利技术的目的是提供一种靶向磷脂酰肌醇聚糖蛋白3(GPC3)的抗体-药物偶联物。本专利技术还提供了所述靶向GPC3的抗体-药物偶联物的制药用途，及其在抑制或预防肿瘤中作用。本专利技术还提供了使用所述靶向GPC3的抗体-药物偶联物治疗哺乳动物细胞或相关病理性情况的方法。本专利技术提供了一种偶联方法，将毒素小分子通过特定连接物偶联到靶向GPC3抗体上，在不改变抗体亲和性的基础上大幅提高抗体对肿瘤细胞的杀伤力。在本专利技术的第一方面，提供了一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：SEQIDNO:2所示的VH-CDR1，SEQIDNO:4所示的VH-CDR2，和SEQIDNO:6所示的VH-CDR3；其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留GPC3结合亲和力的衍生序列。在另一优选例中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO:30。在另一优选例中，所述抗体的重链可变区的核苷酸序列为SEQIDNO:29。在本专利技术的第二方面，提供了一种抗体的重链，所述的重链具有如本专利技术的第一方面所述的重链可变区。在另一优选例中，所述抗体的重链的氨基酸序列为SEQIDNO:34。在另一优选例中，所述抗体的重链的核苷酸序列为SEQIDNO:33。在本专利技术的第三方面，提供了一种抗体的轻链可变区，所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：SEQIDNO:8所示的VL-CDR1，SEQIDNO:10所示的VL-CDR2，和SEQIDNO:12所示的VL-CDR3；其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留GPC3结合亲和力的衍生序列。在另一优选例中，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO:32。在另一优选例中，所述抗体的轻链可变区的核苷酸序列为SEQIDNO:31。在本专利技术的第四方面，提供了一种抗体的轻链，所述的轻链具有如本专利技术的第三方面所述的轻链可变区。在另一优选例中，所述抗体的轻链的氨基酸序列为SEQIDNO:36。在另一优选例中，所述抗体的轻链的核苷酸序列为SEQIDNO:35。在本专利技术的第五方面，提供了一种抗体，所述抗体具有：(1)如本专利技术的第一方面所述的重链可变区；和/或(2)如本专利技术的第三方面所述的轻链可变区；或者，所述抗体具有：如本专利技术的第二方面所述的重链；和/或如本专利技术的第本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗体的重链可变区，其特征在于，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：/nSEQ ID NO:2所示的VH-CDR1，/nSEQ ID NO:4所示的VH-CDR2，和/nSEQ ID NO:6所示的VH-CDR3；/n其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留GPC3结合亲和力的衍生序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗体的重链可变区，其特征在于，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQIDNO:2所示的VH-CDR1，
SEQIDNO:4所示的VH-CDR2，和
SEQIDNO:6所示的VH-CDR3；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留GPC3结合亲和力的衍生序列。


2.一种抗体的重链，其特征在于，所述的重链具有如权利要求1所述的重链可变区。


3.一种抗体的轻链可变区，其特征在于，所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQIDNO:8所示的VL-CDR1，
SEQIDNO:10所示的VL-CDR2，和
SEQIDNO:12所示的VL-CDR3；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留GPC3结合亲和力的衍生序列。


4.一种抗体的轻链，其特征在于，所述的轻链具有如权利要求3所述的轻链可变区。


5.一种抗体，其特征在于，所述抗体具有：
(1)如权利要求1所述的重链可变区；和/或
(2)如权利要求3所述的轻链可变区；
或者，所述抗体具有：如权利要求2所述的重链；和/或如权利要求4所述的轻链，
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留GPC3结合亲和力的衍生序列。


6.如权利要求5所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNo.30所示；和/或，所述的抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNo.32所示；
其中，上述重链可变区的氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并与SEQIDNo.30所示的氨基酸序列具有至少80％同源性或序列相同性的衍生序列；
其中，上述轻链可变区的氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并与SEQIDNo.32所示的氨基酸序列具有至少80％同源性或序列相同性的衍生序列。


7.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白包括：
(i)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。


8.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码选自下组的多肽：
(1)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体；以及
(2)如权利要求7所述的重组蛋白。


9.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求8所述的多核苷酸。


10.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求9所述的载体或基因组中整合有权利要求8所述的多核苷酸。


11.一种抗体偶联物，其特征在于，所述抗体偶联物含有：
(a)抗体部分，所述抗体部分含有选自下组的元件：如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链，或所述抗体部分为权利要求5所述的抗体；和
(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。


12.一种免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞表达或在细胞膜外暴露有权利要求5所述的抗体。


13.一种基于闭环或开环马来酰亚胺的抗体-药物偶联物，其特征在于，所述的偶联物具有式Ia和/或Ib所示的结构；



其中，
Ar'选自下组：取代或未取代的C6-C10芳基，取代或未取代的5-12元杂芳基，取代或未取代的C6-C10亚芳基，取代或未取代的5-12元亚杂芳基；
L1为连接于Ar'基团上的-O(CH2CH2O)n-，其中n选自1-20中任一整数，优选为1-10中任一整数；
L2为化学键或AA-PAB结构；其中，AA为二肽或三肽或四肽片断(即2-4个氨基酸组成的多肽片断)，PAB为对-氨基苄基氨甲酰基；
CTD为通过酰胺键键合于L2的细胞毒类小分子药物和/或治疗自身免疫疾病和抗炎症的药物；
m为1.0～5.0，优选为3.0-4.2；更优选为3.5-4.5；又更优选为3.8-4.2，又更优选为3.9-4.1，最优选为4.0；
抗体(Ab)为靶向磷脂酰肌醇聚糖蛋白3(...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈竞康，孟韬，康小强，赖寿鹏，马兰萍，彭红丽，王昕，陈驎，杜志彦，王英，于霆，张永良，
申请(专利权)人：中国科学院上海药物研究所，南京维立志博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31