抗MSLN单克隆内化抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种抗MSLN单克隆内化抗体及其制备方法和应用，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO：1所示的重链可变区CDR1；如SEQ ID NO：3所示的重链可变区CDR2；如SEQ ID NO：5所示的重链可变区CDR3；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：7所示的轻链可变区CDR1；如SEQ ID NO：9所示的轻链可变区CDR2；和如SEQ ID NO：11所示的轻链可变区CDR3。本发明专利技术的抗体特异性好，亲合力较高，可结合细胞表面表达，并可被细胞高效转运至胞内，携带毒素分子同步进入细胞从而将细胞杀死，该抗体可广泛应用在肿瘤免疫治疗的药物中。药物中。药物中。

【技术实现步骤摘要】
抗MSLN单克隆内化抗体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及一种单克隆抗体及其制备方法和应用，尤其涉及一种抗MSLN单克隆内化抗体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]间皮素(mesothelin，MSLN)是位于细胞表面的40KD的糖蛋白，通过糖基磷脂酰肌醇锚定于细胞膜上。间皮素基因编码一种69kDa的前体蛋白，被弗林蛋白酶(成对碱性氨基酸蛋白酶，furin)样转化酶水解为两条链，C端约40KD的膜结合蛋白即为成熟的间皮素，N端约30KD称之为巨核细胞促进因子(MPF)的片断脱落并释放出细胞外。MPF和膜锚MSLN均为N
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糖基化，MPF可在体外促进巨核细胞克隆的形成，膜锚MSLN可以与MUC16(亦称CA125)互作，在细胞粘附过程中起重要作用，因此目前靶向治疗中均选择膜锚MSLN做为靶点，故目前MSLN专指MSLN的C端40KD片段，即膜锚MSLN。
[0003]在正常情况下，MSLN仅低表达于胸膜、腹膜、心包膜等间皮组织中，在其它组织中不表达，表达谱极窄。但在癌变组织中，MSLN的强表达却极其普遍，目前已在间皮瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、胰腺癌等多种实体瘤肿瘤组织中检测到很高的表达量，甚至食道癌、转移性三阴性乳腺癌和肾癌中也有MSLN的表达。就癌细胞系而言，已知MSLN高表达于HO
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8910、HEY
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T30、OVCAR3(特别是HO
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8910)三种卵巢癌细胞系、转移胰腺癌细胞系AsPC1和宫颈癌细胞系Hela中，在SKOV3、3AO二种卵巢癌细胞系和肺腺癌细胞系A549极低表达，而在人肝癌细胞系Huh7不表达。
[0004]就细胞水平而言，MSLN参与了(癌)细胞增殖、凋亡、粘附等细胞生物学过程，并对化疗的效果产生不利影响。例如，MSLN表达下调的SKOV3细胞用于小鼠移植瘤构建时成瘤能力下降，同时亦可造成该细胞凋亡增加以及癌组织的转移减弱。阻断MSLN与MUC16结合则细胞粘附能力下降。下调MSLN表达后，癌组织对顺铂及紫杉醇的敏感性增加。另外观察到MSLN过表达会引起金属蛋白酶9的过表达，从而促进了肿瘤细胞的迁移和浸润。因此可以推测，MSLN通过与MUC16相互作用引起金属蛋白酶9以及其它蛋白的表达，进而引起细胞增殖、粘附、凋亡等过程的相应改变，在肿瘤腹膜转移的侵袭过程中发挥重要作用，且能够促进肿瘤细胞抗凋亡。
[0005]MSLN在正常细胞中几乎不表达(仅低表达于胸膜、腹膜、心包膜)而在多种癌组织中强烈表达的特点，使其成为靶向治疗的良好靶点，决定了以其做为靶点的靶向治疗天然具有脱靶效应低、适应症广的潜在优势。比如MSLN在60
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90％的肺癌组织中表达，其中20％表达量较高，但在正常肺组织中不表达，且MSLN高表达的肺腺癌预后较差，提示MSLN是治疗肺癌的一个潜在靶标。实验证实，以MSLN为靶点的CART经尾静脉回输荷瘤小鼠后，皮下接种高表达MSLN的肺腺癌组织造成的肿瘤体积增长明显被抑制。
[0006]鉴于以MSLN为靶点的靶向治疗展现出的适应症广、可能的脱靶效应低的特点，以MSLN为靶点的治疗方案向多个方向展开研发，包括重组单克隆单特异抗体药、双特异抗体、合成蛋白、抗体偶联药物(毒素或放射性同位素)、疫苗和过继性免疫细胞治疗等12个药物
进行临床试验(抗体类药物5个)。其中由美国国立癌症研究所研发的Amatuximab单抗(MORAb
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009)已完成治疗恶性间皮瘤的二期临床试验。
[0007]就目前研发中的抗体而言，虽然已知的许多间皮素单克隆抗体都是可用的，但是没有一个可以展现出针对于肿瘤细胞的补体依赖的细胞毒作用(complement dependent cytotoxicity,CDC)。抗体特异地与细胞表面的抗原结合，其Fc区则招募C1q，进而激活补体激活的经典途径，最终在表达抗原的细胞表面形成攻膜复合物，引起靶细胞裂解。可见该作用有助于癌症治疗。利用传统杂交瘤技术获得强CDC效应的靶向MSLN的抗体是一件困难的事情。比如传统方法获得的抗体组织穿透力差治疗效果不足、免疫原性强需要人源化改造、稳定性差运输和保存要求高。总之，已有的传统抗体尽管为疾病的治疗/检测起到了极其重要的作用，但目前已有的、以MSLN为靶点的抗体，其不足之处亦很明显。
[0008]目前处于临床阶段的MSLN靶点药物共12个，其中包括Amatuximab在内的抗体类药物共5个。这些抗体为人
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鼠嵌合抗体或人源化抗体，均来源于小鼠，采用杂交瘤技术获得。目前靶向MSLN的疗法有细胞治疗及裸抗，临床效果有限，特别是对实体瘤来说，这两种方法几乎无效。研发人员普遍认为，抗体药物偶联物(antibody
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drug conjugate，ADC)将是未来针对该靶点的癌症治疗的希望之一。另外这些抗体并非全人源抗体，与全人源抗体相比，存在着免疫原性较高、安全性较差、体内稳定性可能较低的问题。

技术实现思路

[0009]专利技术目的：本专利技术的目的是提供一种具有细胞内化功能、CDC作用的抗MSLN单克隆内化抗体；本专利技术的另一目的是提供一种抗MSLN单克隆内化抗体的制备方法；本专利技术的另一目的是提供一种抗MSLN单克隆内化抗体的应用。
[0010]技术方案：本专利技术的抗MSLN单克隆内化抗体，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO：1所示的重链可变区CDR1；如SEQ ID NO：3所示的重链可变区CDR2；和如SEQ ID NO：5所示的重链可变区CDR3。
[0011]所述SEQ ID NO：1为GYTFTSYY；所述SEQ ID NO：3为INPSGGST；所述SEQ ID NO：5为ARDRGTYYYGSGDLGY。
[0012]进一步地，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：7所示的轻链可变区CDR1；如SEQ ID NO：9所示的轻链可变区CDR2；和如SEQ ID NO：11所示的轻链可变区CDR3。
[0013]所述SEQ ID NO：7为QGISTW；所述SEQ ID NO：9为AAS；所述SEQ ID NO：11为QQANSFPLT。
[0014]进一步地，所述抗体是全人源抗体。
[0015]进一步地，所述抗体与癌细胞表面MSLN抗原特异性结合。
[0016]另一方面，本专利技术提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码上述的单克隆内化抗体。
[0017]另一方面，本专利技术提供了一种表达载体，所述表达载体包括上述的核酸分子。
[0018]另一方面，本专利技术提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括上述的表达载体。
[0019]另一方面，本专利技术提供了一种抗MSLN单克隆内化抗体的制备方法，所述方法包括通过培养包括上述的宿主细胞。具体的方法如下：
[0020]以商品化的重组人MSLN生物素标签蛋白和噬菌体展示抗体库为起始本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗MSLN单克隆内化抗体，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，其特征在于，所述重链可变区包含如SEQ ID NO：1所示的重链可变区CDR1；如SEQ ID NO：3所示的重链可变区CDR2；和如SEQ ID NO：5所示的重链可变区CDR3。2.根据权利要求1所述的单克隆内化抗体，其特征在于，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：7所示的轻链可变区CDR1；如SEQ ID NO：9所示的轻链可变区CDR2；和如SEQ ID NO：11所示的轻链可变区CDR3。3.根据权利要求1所述的单克隆内化抗体，其特征在于，所述抗体与癌细胞表面MSLN抗原特异性结合。4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1
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【专利技术属性】
技术研发人员：张军锋，郭志刚，
申请(专利权)人：南京蓝盾生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：