间皮素特异性嵌合抗原受体及表达它的T细胞制造技术

本发明专利技术涉及一种嵌合抗原受体和表达所述嵌合抗原受体的免疫细胞，并且更具体地，涉及一种嵌合抗原受体和表达所述嵌合抗原受体的免疫细胞，优选T细胞，所述嵌合抗原受体包含：抗间皮素抗体或其片段；CD8α的信号肽；CD28或CD8α的铰链；CD28或CD8α的跨膜结构域；以及包含CD28、4

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】间皮素特异性嵌合抗原受体及表达它的T细胞


[0001]本专利技术涉及一种间皮素特异性嵌合抗原受体和表达所述嵌合抗原受体的T细胞。

技术介绍

[0002]T细胞在适应性免疫中起重要作用。T细胞通过抗原识别受体(T细胞受体，TCR)、共刺激分子和细胞因子的刺激而被激活。此外，TCR信号由与引起T细胞激活的抗原结合的主要组织相容性复合物(MHC)分子触发，但癌细胞通过下调MHC分子的表达作为避免抗原识别的机制来避开免疫系统。基于T细胞的这些特征，正在开发免疫细胞疗法(过继免疫疗法、过继细胞疗法)。
[0003]开发嵌合抗原受体(CAR)以允许T细胞在没有MHC分子的情况下直接识别抗原。嵌合抗原受体由识别靶抗原的单链可变片段(scFv)、跨膜结构域和将信号传送到细胞中的信号传导结构域构成。将嵌合抗原受体人工引入T细胞中，使得T细胞(CAR
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T细胞)可以识别具有特定抗原的癌细胞。目前，美国的跨国制药公司如Novartis、Gilead、Juno Therapeutics和Celgene都开发了针对血癌作为适应症的CAR
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T疗法，但对与之相关的实体癌的研究仍是一个挑战。
[0004]间皮素(MSLN)为在细胞表面上表达的40kDa糖蛋白。发现MSLN在正常组织中很少表达，但会在几种类型的实体癌(包括间皮瘤、胰腺癌和卵巢癌)中过表达，并且正在进行关于它的研究作为抗癌靶标(Chang K 1996,Raffot.H 2004)。在此基础上，美国宾夕法尼亚大学的由Carl H.June博士领导的小组与Novartis合作，正在研究含有小鼠衍生的抗间皮素scFv的间皮素靶向嵌合抗原受体(ss1 CAR)。将ss1 CAR mRNA递送至T细胞，并将瞬时表达的CAR T施用于患者。他们发现，在患者中发生了人抗小鼠抗体应答(HAMA应答)(Beatty GL 2014)。
[0005]本专利技术人开发了一种包含特异性靶向间皮素的人源scFv的嵌合抗原受体，其可用于治疗表达间皮素的癌症，从而解决人抗小鼠抗体应答的常规问题，并且发现表达包含所述人源间皮素特异性scFv的嵌合抗原受体的T细胞展现出优异的抗肿瘤功效。基于此发现，完成本专利技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术的一个目的是提供一种包含间皮素结合结构域的新型嵌合抗原受体，其能够展现出优异的抗癌效果并解决使用表达包含间皮素结合结构域的嵌合抗原受体的常规T细胞的抗癌免疫细胞疗法的问题；表达所述嵌合抗原受体的T细胞；包含所述免疫细胞的用于癌症治疗的组合物；以及使用它们治疗癌症的方法。
[0007]本专利技术的另一个目的是提供所述T细胞用于癌症治疗的用途。
[0008]本专利技术的另一个目的是提供所述T细胞用于制备用于治疗癌症的治疗剂的用途。
[0009]为了实现上文目的，本专利技术提供一种嵌合抗原受体，其包含与间皮素(MSLN)特异性结合的结合结构域。
[0010]根据本专利技术的间皮素(MSLN)的结合结构域优选为抗间皮素抗体或其片段，但不限于此。
[0011]根据本专利技术的嵌合抗原受体中包括的抗间皮素抗体或其片段包含：重链可变区，其包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:45、51或57的重链CDR1，具有氨基酸序列SEQ ID NO:46、52或58的重链CDR2，和具有氨基酸序列SEQ ID NO:47、53或59的重链CDR3；以及轻链可变区，其包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:48、54或60的轻链CDR1、具有氨基酸序列SEQ ID NO:49、55或61的轻链CDR2，和具有氨基酸序列SEQ ID NO:50、56或62的轻链CDR3。
[0012]本专利技术还提供一种编码间皮素特异性嵌合抗原受体(CAR)的核酸、一种包含所述核酸的表达载体、表达所述嵌合抗原受体的免疫细胞、一种包含所述免疫细胞的用于治疗癌症的组合物以及一种用于使用它们来治疗癌症的方法。
[0013]本专利技术还提供所述免疫细胞用于癌症治疗的用途。
[0014]本专利技术还提供所述免疫细胞用于制备用于治疗癌症的治疗剂的用途。
附图说明
[0015]图1a显示酶联免疫吸附测定(ELISA)的结果，其评估MS501 scFv、MS503 scFv或C2G4 scFv与根据本专利技术的实施方案的重组人间皮素(rhMSLN)的结合活性。
[0016]图1b显示流式细胞术分析的结果，其评估MS501 scFv、MS503 scFv或C2G4 scFv与根据本专利技术的实施方案的MIA PaCa2
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MSLN细胞的细胞结合活性。
[0017]图2a为显示根据本专利技术的实施方案的体外实验中所使用的CAR结构的示意图。
[0018]图2b显示流式细胞术分析的结果，其鉴别用根据本专利技术的实施方案的501(28H)28z、503(28H)28z或C2G4(28H)28z转导的Jurkat细胞中的CAR表达。
[0019]图2c显示用根据本专利技术的实施方案的501(28H)28z、503(28H)28z或C2G4(28H)28z转导的Jurkat细胞的嵌合抗原受体(CAR)和绿色荧光蛋白(GFP)表达。
[0020]图3a显示流式细胞术分析的结果，其确定用根据本专利技术的实施方案的501(28H)28z、503(28H)28z或C2G4(28H)28z转导的Jurkat细胞响应于表达间皮素的靶细胞(即，HeLa(宫颈癌)细胞、OVCAR3(卵巢癌)细胞和CAPAN1(胰腺癌)细胞)的细胞活性。
[0021]图3b显示酶联免疫沉淀测定的结果，其评估在图3a中用501(28H)28z、503(28H)28z或C2G4(28H)28z转导的Jurkat细胞的间皮素特异性激活时的细胞因子产生能力。
[0022]图4a显示流式细胞术分析的结果，其确定在用根据本专利技术的实施方案的501(28H)28z、503(28H)28z或C2G4(28H)28z转导的Jurkat细胞的间皮素特异性激活时的细胞活性。
[0023]图4b显示酶联免疫沉淀测定的结果，其评估在图4a中用501(28H)28z、503(28H)28z或C2G4(28H)28z转导的Jurkat细胞的间皮素特异性激活时的细胞因子产生能力。
[0024]图5a显示流式细胞术分析的结果，其确定用根据本专利技术的实施方案的501(28H)28z或C2G4(28H)28z转导的人T细胞的CAR表达。
[0025]图5b显示在图5b中用501(28H)28z或C2G4(28H)28z转导的人T细胞的间皮素特异性反应时的细胞毒性活性。
[0026]图5c显示酶联免疫沉淀测定的结果，其评估在图5b中用501(28H)28z、503(28H)28z或C2G4(28H)28z转导的人T细胞的间皮素特异性激活时的细胞因子产生能力。
[0027]图5d显示图5a中用501(28H)28z、503(28H)28z或C2G4(28H本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含特异性结合间皮素(MSLN)的结合结构域。2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其还包含选自信号序列、铰链、跨膜结构域和细胞内结构域的至少一种。3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中间皮素(MSLN)的所述结合结构域为抗间皮素抗体或其片段，其包含含有以下重链CDR的重链可变区和含有以下轻链CDR的轻链可变区：包含氨基酸序列SEQ ID NO:45的重链CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:46的重链CDR2、包含氨基酸序列SEQ ID NO:47的重链CDR3、包含氨基酸序列SEQ ID NO:48的轻链CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:49的轻链CDR2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:50的轻链CDR3；包含氨基酸序列SEQ ID NO:51的重链CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:52的重链CDR2、包含氨基酸序列SEQ ID NO:53的重链CDR3、包含氨基酸序列SEQ ID NO:54的轻链CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:55的轻链CDR2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:56的轻链CDR3；或包含氨基酸序列SEQ ID NO:57的重链CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:58的重链CDR2、包含氨基酸序列SEQ ID NO:59的重链CDR3、包含氨基酸序列SEQ ID NO:60的轻链CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:61的轻链CDR2、包含氨基酸序列SEQ ID NO:62的轻链CDR3。4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中间皮素(MSLN)的所述结合结构域为抗间皮素抗体或其片段，其包含以下重链可变区和轻链可变区：包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的重链可变区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:40的轻链可变区；包含氨基酸序列SEQ ID NO:41的重链可变区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的轻链可变区；或包含氨基酸序列SEQ ID NO:43的重链可变区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:44的轻链可变区。5.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中间皮素(MSLN)的所述结合结构域为所述抗间皮素抗体的单链可变片段(scFv)。6.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体，其中所述抗间皮素抗体的所述单链可变片段(scFv)包含由EQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6表示的氨基酸序列。7.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体，其中所述信号序列包含CD8α的信号序列。8.根据权利要求7所述的嵌合抗原受体，其中CD8α的所述信号序列包含由SEQ ID NO:8表示的氨基酸序列。9.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体，其中所述铰链包含CD28或CD8α的铰链。10.根据权利要求9所述的嵌合抗原受体，其中CD28或CD8α的所述铰链的序列包含由SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:16表示的氨基酸序列。11.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域(TM)包含CD28或...

【专利技术属性】
技术研发人员：安钟成，权美璇，金雅麟，李贤镐，金彦娇，
申请(专利权)人：格林克塞尔，
类型：发明
国别省市：