一种分泌PD1抗体的靶向mesothelin的CAR-T细胞及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种分泌PD1抗体的靶向mesothelin的CAR

【技术实现步骤摘要】
一种分泌PD1抗体的靶向mesothelin的CAR
‑
T细胞及其制备方法


[0001]本专利技术属于医药生物领域，涉及一种分泌PD1抗体的靶向mesothelin的 CAR
‑
T细胞及其制备方法。

技术介绍

[0002]嵌合抗原受体(CAR)是模拟T细胞受体功能的人工受体，其融合了抗原与抗体或配体与受体的识别和结合特异性以及效应T细胞对被识别的肿瘤细胞的杀伤能力；CAR由CD8a引导肽、抗原识别区(配体或单链抗体或Fab片段)、跨膜区、以及T细胞的一系列信号转导区(CD28，CD3，CD137胞内信号传导结构域)依次连接而成。T细胞经修饰后，表面表达的CAR首先通过抗原识别区与肿瘤细胞表面抗原结合，然后通过其信号转导区将活化信号传递至胞内，靶向地激活T细胞对肿瘤细胞杀伤活性。将表达CAR的DNA序列克隆入慢病毒表达载体，并感染从患者血中分离出的T细胞，使T细胞表面表达相应的CAR，再将此修饰的T细胞再输回患者体内，修饰后的T细胞可以在患者体内靶向性地杀伤表达相关抗原的肿瘤细胞，达到清除肿瘤细胞的效果。
[0003]虽然CAR
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T细胞免疫治疗在动物模型和患者身上表现了令人振奋的作用，但二代、三代CAR
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T细胞在实体瘤治疗领域仍面临巨大挑战，主要包括：缺乏肿瘤特异性抗原，从而存在攻击正常细胞引起严重副反应的风险；T细胞难以有效的到达肿瘤部位，CAR
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T细胞浸润实体瘤的能力不足、存活时间短，以及一系列的免疫抑制分子及免疫抑制肿瘤微环境等均会限制CAR
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T细胞的抗肿瘤疗效，如T细胞膜蛋白3(TIM
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3)、淋巴细胞激活因子3(LAG
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3)、细胞毒性T 淋巴细胞
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4(CTLA
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4)、程序性细胞死亡蛋白1(PD
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1)及其两个主要配体PD
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L1、 PD
‑
L2等。
[0004]肿瘤抑制性免疫微环境是CAR
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T在实体瘤中疗效不佳的重要原因。程序性死亡受体1(PD
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1)是T细胞活化的负调节，通过与其两个配体PD
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L1、PD
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L2 相互作用来限制T细胞的活性。抑制免疫负调控取得了突破性进展，例如抗 CTLA
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4、抗PD
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1、抗PD
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L1等免疫检查点单抗阻断质量，开创了癌症治疗新时代。目前应用于临床研究的PD
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1或者PD
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L1抗体，通过阻断PD
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1或者PD
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L1 通路，部分恢复T细胞的功能，使其能够继续杀伤肿瘤细胞具有治疗多种类型肿瘤的潜力。恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌、头颈鳞状上皮细胞癌、霍奇金淋巴瘤、肾细胞癌、结直肠癌、卵巢癌等都均显示良好的临床疗效。且PD
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1和PD
‑
L1 的单抗已被美国食品药品监督局(FDA)批准用于复发或难治性恶性黑色素瘤或非小细胞肺癌的治疗。
[0005]MESOTHELIN是一种肿瘤相关抗原，在大多数的恶性胸膜间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌及某些肺癌中有表达，并且正常组织中表达范围窄、表达量低。因而可以作为恶性胸膜间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌的免疫治疗靶点.
[0006]本技术方案采用的是第四代的CAR结构，CAR
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T细胞在识别Mesothelin的同时能够分泌PD
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1抗体，分泌的PD
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1抗体可以阻断肿瘤细胞表面PD
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L1分子与CAR
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T细胞的结合，从而解除PD
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L1对CAR
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T细胞的抑制作用，本技术方案因此能够提高CAR
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T细胞对肿瘤细胞的
杀伤作用。

技术实现思路

[0007]专利技术目的：本专利技术的目的是提供了一种分泌PD1抗体的靶向mesothelin的CAR
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T细胞及其制备方法。
[0008]技术方案：在本专利技术的第一方面，本专利技术提供了一种分泌PD1抗体的靶向mesothelin的CAR
‑
T细胞，
[0009]包括如下细胞：
[0010]表达MSLN
‑
CAR的T细胞；
[0011]表达MSLN
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CAR的同时分泌PD1抗体的T细胞；在本专利技术中，术语MSLN
‑
CAR指MSLN嵌合抗原受体，包含有靶向MSLN的scFv序列；
[0012]scFv序列：全称single
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chainantibodyfragment，即单链抗体片段；
[0013]在本专利技术中，术语MSLN
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scFv指抗MSLN单链抗体片段，氨基酸序列如SEQIDNO.3所示；
[0014]所述CAR
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T细胞用于分泌PD1抗体(所述CAR
‑
T细胞表达MSLN
‑
CAR的同时分泌PD1抗体)；即所述CAR
‑
T细胞同时表达MSLN
‑
CAR和PD1抗体；
[0015]其中，所述PD1抗体的氨基酸序列如SEQNO.1所述；
[0016]所述表达的MSLN
‑
CAR和PD1抗体的氨基酸序列如SEQIDNO.8所述；
[0017]核酸序列如SEQIDNO.9所述。
[0018]进一步的，所述MSLN
‑
CAR包括信号肽、胞外区、铰链区、跨膜区、共刺激信号域及胞内信号结构域。
[0019]进一步的，所述的信号肽为CD8a信号肽，其氨基酸序列如SEQNO.2所述；
[0020]所述胞外区为靶向mesothelin的scfv，其氨基酸序列如SEQNO.3所述；
[0021]所述铰链区为CD8a，其氨基酸序列如SEQNO.4所述；
[0022]所述跨膜区为CD8a，其氨基酸序列如SEQNO.5所述；
[0023]所述共刺激信号域为4
‑
1BB，其氨基酸序列如SEQNO.6所述；
[0024]所述胞内信号结构域为CD3zeta，其氨基酸序列如SEQNO.7所述。
[0025]进一步的，在本专利技术的第二方面，本专利技术提供了一种分泌PD1抗体的靶向mesothelin的CAR
‑
T细胞制备方法，具体制备步骤如下：
[0026](1)、构建携带MSLN
‑
CAR及PD1抗体核酸序列的重组慢病毒质粒；
[0027](2)、将携带MSLN
‑
CAR及PD1抗体的的重组慢病毒质粒及辅助质粒转染宿主细胞，制备可感染T细胞的重组慢病毒本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分泌PD1抗体的靶向mesothelin的CAR
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T细胞，其特征在于，所述CAR
‑
T细胞同时表达MSLN
‑
CAR和PD1抗体；其中，所述PD1抗体的氨基酸序列如SEQ NO.1所述；所述表达的MSLN
‑
CAR和PD1抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所述；核酸序列如SEQ ID NO.9所述。2.根据权利要求1所述的一种分泌PD1抗体的靶向mesothelin的CAR
‑
T细胞，其特征在于，所述MSLN
‑
CAR包括信号肽、胞外区、铰链区、跨膜区、共刺激信号域及胞内信号结构域。3.根据权利要求2所述的一种分泌PD1抗体的靶向mesothelin的CAR
‑
T细胞，其特征在于，所述的信号肽为CD8a信号肽，其氨基酸序列如SEQ NO.2所述；所述胞外区为靶向mesothelin的scfv，其氨基酸序列如SEQ NO.3所述；所述铰链区为CD8a，其氨基酸序列如SEQ NO.4所述；所述跨膜区为CD8a，其氨基酸序列如SEQ NO.5所述；所述共刺激信号域为4
‑
1BB，其氨基酸序列如SEQ NO.6所述；所述胞内信号结构域为CD3zeta，其氨基酸序列如SEQ NO.7所述。4.如权利要求1
‑
3所述的一种分泌PD1抗体的靶向mesothelin的CAR
‑
T细胞制备方法，其特征在于，具体制备步骤如下：(1)、构建携带MSLN
‑
CAR及PD1抗体核酸序列的重组慢病毒质粒；(2)、将携带MSLN...

【专利技术属性】
技术研发人员：李俊，郭志刚，
申请(专利权)人：南京蓝盾生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：