双基因定点整合通用型CAR-T细胞的制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及制备双基因敲入的通用型CAR

【技术实现步骤摘要】
双基因定点整合通用型CAR
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T细胞的制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及细胞治疗领域，特别涉及双基因定点整合通用型CAR
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T细胞的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]CAR
‑
T治疗
[0003]传统肿瘤治疗药物包括化疗药、靶向药，虽然它们在一定程度上提高了癌症患者的生存期，但同时也带来了严重的副作用，极大地降低了病人的生存质量。更不幸的是，大部分患者在接受这些传统治疗后仍旧会复发，而一旦复发，无药可救是大概率事件。
[0004]近年来，随着免疫治疗的发展，免疫检验点抑制剂药物(如CTLA
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4、PD
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1/PD
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L1抗体)的出现，彻底改变了肿瘤治疗的方式。但这类药物在不同癌症病人中的有效率只有20％
‑
40％，仍然有大部分的癌症患者等待新的有效治疗方式的出现。
[0005]嵌合抗原受体T细胞(CAR
‑
T细胞)治疗技术是通过体外转导一个识别癌细胞表面抗原的人工基因于T细胞上，使T细胞具有特异杀伤肿瘤细胞的能力。CAR
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T细胞治疗属于过继性免疫疗法(adoptive cell transfer，ACT)，它利用人体免疫细胞来对抗肿瘤，被称为“活体药物”。这种ACT疗法在近年已应用于临床实验当中，特别是在各种白血病方面的有效探索，为研究者以及医生开辟了一条治疗肿瘤的新路径。CAR
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T药物与传统药物相比具有如下创新点：
[0006]首先，精确靶向肿瘤，且副作用可逆。CAR
‑
T细胞治疗相比化疗药、靶向药具有更特异的肿瘤细胞杀伤能力。在输入病人体内后，虽然短时间内会产生细胞因子效应，但该副反应可控，病人在获得完全缓解的情况下基本上能和健康人一样生活。
[0007]其次，持续缓解时间长。CAR
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T细胞部分属于记忆T细胞，在输入病人体内后能长期存在于病人身体中，时刻监视身体中是否出现肿瘤细胞，一旦有新的肿瘤细胞出现就会立刻将其杀灭。
[0008]通用型CAR
‑
T治疗
[0009]通用型CAR
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T(Universal CAR
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T，UCAR
‑
T)取自健康人血液，经过基因编辑技术改造后回输给不同患者。它在已有T细胞上敲除某些基因，使得外来的健康人T细胞不会攻击患者体内细胞引起抗宿主排异反应(GvHD效应)，以及不会被患者免疫系统清除，从而存活在患者体内发挥肿瘤杀伤的作用。通用型CAR
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T是摆放在货架的药物，因为它取自已有健康人T细胞，可按照生产药物的严格标准大规模量产。通用型CAR
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T相比较自体CAR
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T，具备“摆在货架上(off
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the
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shelf)”的特点：
[0010]首先，随时可用，因无需使用患者T细胞，可提前制备，因此是一种“摆在货架上的药品”，可随时取用，病人无需等待。
[0011]其次，可规模化量产，成本大幅降低。不是“私人订制”，可大规模批量生产。一个健康人采血400ml，即可制备满足上百位患者的UCAR
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T细胞制品。初步预测单剂量的UCAR
‑
T，其成本将是自体CAR
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T成本的1/10。
[0012]第三，无使用限制。因采用健康人血液提取T细胞制备，无需患者自身提供，因此不受患者身体状况(T细胞状态)左右，没有使用限制。
[0013]然而，通用型CAR
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T治疗仍需克服以下问题：
[0014]1)同种异体T细胞移植相容问题
[0015]虽然通用型CAR
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T治疗有诸多的优势，但是其生产制作和研发难度要大大高于自体CAR
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T治疗。其中最影响其疗效的是同种异体排异问题：不同的个体，其组织相容性抗原存在差异，从而导致了受体T细胞对移植物的攻击和排异。为解决这个问题，通常利用基因编辑的方法(如ZFN、TALEN或CRISPR
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Cas9)将CAR
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T细胞中的B2M基因敲除，从而使HLA
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ABC蛋白无法在细胞表面展示，进而可以避免被受体T细胞攻击。也有一些研究者将CIITA基因一并敲除，来降低二类组织相容性抗原的表达。
[0016]2)移植物抗宿主反应(GvHD)
[0017]移植物抗宿主反应(graft versus host disease，GVHD)是由移植物中的特异性淋巴细胞识别宿主抗原而发生的一种反应。其产生的条件是移植物中包含T淋巴细胞及移植物与宿主的主要组织相容性抗原不一致。在骨髓移植中，GvHD是主要的障碍，其会杀伤宿主体内的细胞而导致多器官功能衰竭，进而引起其他并发症。在通用型CAR
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T细胞治疗中，GvHD是最需要避免的一个问题，否则宿主有严重的副作用。TCR是T淋巴细胞识别靶细胞主要基因，敲除TCR基因可以避免异体T细胞对宿主细胞的攻击，所以异体移植的通用型CAR
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T细胞必须将TCR基因敲除才能避免GvHD。
[0018]CAR基因转导
[0019]CAR
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T细胞的制备可以分为以下几个步骤：T细胞分离、T细胞激活、CAR基因转导、CAR
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T细胞扩增、CAR
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T细胞收获。其中CAR基因转导是整个制备过程的核心。近年来，已发展出多个CAR转导方式：
[0020]1)慢病毒或者逆转录病毒
[0021]慢病毒或逆转录病毒可用于转染3000个碱基以下的目的DNA，其优势在于：a.较高的感染效率，通常转染后阳性率最高可以达到50％左右；b.病毒分泌到培养基中较多，小规模浓缩纯化相对容易；c.T淋巴细胞感染病毒后能保持一个良好的细胞状态，存活和扩增不易受到影响，有利于后续回输给病人。其不足之处在于：a.随机插入细胞基因组中，容易导致产生的CAR
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T细胞耗竭及潜在的癌变风险；b.感染T细胞后，残留的病毒有强免疫原性；c.病毒大规模制备较为繁琐，成本较高。
[0022]2)转座子
[0023]转座子转导方式优势在于简单的生产工艺流程，无病毒残留的风险。但由于编码转座子的载体为质粒DNA，其在电穿孔入T细胞后有细胞毒性作用，不利于产生的CAR
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T细胞扩增。同样，转座子介导也是随机性地将CAR基因插入到T细胞基因组中，容易导致产生的CAR
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T细胞耗竭及潜在的癌变风险。
[0024]3)mRNA
[0025]mRNA编码的CAR基因转导T细胞依赖于电穿孔，其优势在于只短暂地表达目的蛋白于T细胞中(大约表达7天)，对于前期不确定是否存在严重副本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备双基因敲入的通用型CAR
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T细胞的方法，所述方法包括：将基因编辑物质递送至T细胞以敲除B2M基因和TRAC基因；和将修复模板载体递送至T细胞以将CAR基因和B2M
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HLA
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E基因敲入TRAC或B2M位点。2.根据权利要求1所述的方法，其中使用选自ZFN、TALEN、CRISPR
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Cas9和megaTAL的基因编辑方法递送所述基因编辑物质，优选CRISPR
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Cas9；所述基因编辑物质是质粒、慢病毒、逆转录病毒、腺相关病毒、mRNA或RNA蛋白复合体，优选mRNA；并且递送所述基因编辑物质的方式包括使用脂质体、磷酸钙、DEAE
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葡聚糖、电穿孔、显微注射或基因枪的转染方法，优选电穿孔转染。3.根据权利要求2所述的方法，其中CRISPR
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Cas9基因编辑物质包括Cas9 mRNA或Cas9蛋白和sgRNA，优选地，sgRNA是化学修饰的，其中化学修饰包括2
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O
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甲基化、3
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硫代以及2
‑
O
‑
甲基化结合3
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硫代，优选地，化学修饰发生在sgRNA的5
’
和3
’
端的1至10个碱基，优选地，sgRNA的5
’
和3
’
端3个碱基同时进行2
‑
O
‑
甲基化和3
‑
硫代修饰，优选地，靶向TRAC和B2M基因的sgRNA序列分别如SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56所示。4.根据权利要求3所述的方法，其中Cas9包括SpCas9、SaCas9、SpCas9
‑
HF、eSpCas9、xCas9和cpf1，优选SpCas9，更优选其氨基酸序列如SEQ ID NO:57所示。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述修复模版载体包括腺相关病毒和非病毒载体。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述修复模版载体中的模版DNA包括左同源臂、敲入基因和右同源臂。7.根据权利要求6所述方法，其中左同源臂和右同源臂分别具有10至2000bp的片段长度，优选地300bp、600bp或1000bp的片段长度，更优选地300bp的片段长度，优选地，敲入TRAC基因组位点时，左右同源臂DNA分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，优选地，敲入B2M基因组位点时，左右同源臂DNA分别如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO:8所示。。8.根据权利要求6所述的方法，其中当敲入TRAC位点并且依赖TCR
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alpha启动子时，所述敲入基因包含：剪切肽、CAR基因、剪切肽、B2M
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HLA
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E基因和Poly A；当敲入TRAC位点并且依赖外源启动子时，所述敲入基因包含：外源启动子、CAR基因、剪切肽、B2M
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HLA
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E基因和Poly A，当敲入B2M位点并且依赖B2M基因启动子时，所述敲入基因包含：B2M
‑
HLA
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E基因、剪切肽、CAR基因和Poly A；优选地，外源启动子为EF1，DNA序列如SEQ ID NO:26所示；优选地，剪切肽是P2A，其氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；优选地，Poly A是miniPolyA或bGHpA polyA，DNA序列分别如SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述CAR基因针对的抗原靶点选自CD19、CD22、CD20、CD7、CD5、CD4、CD123、CD30、CD33、CD70、CD38、CD138、BCMA、SLAMF7、PSMA、HER2、HER3、
B7
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H3、Mesothelin、CS1、MUC16、GD2、GUCY2C、ROR1、GPC3、FAP、FOLR1、CEA、CD138、CD56、CD147、EpCAM、CAIX、EGFR、Claudin 18.2、Claudin 6、CLL
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1、GPRC5D、Nectin
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4、EGFRVIII、LewisY、DLL3、uPAR、MG7和IL13Rα2中的一个或多个。10.根据权利要求8所述的方法，其中所述CAR基因包含信号肽、抗原结合区、铰链区、跨膜区、一个或两个共刺激结构和激活区，优选地，所述信号肽选自CD8、IL
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2、GM
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CSF信号肽结构域，优选地CD8信号肽结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示，优选地，所述抗原结合区是抗体scFv或相应配体，优选地CD19抗体scFv，其氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，优选地，所述铰链区选自IgG1、IgG4、IgD和CD8铰链结构域，优选地CD8铰链结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示，优选地，所述跨膜区选自CD...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭作翰，刘佳玫，豆亚丽，徐之艳，李玏，
申请(专利权)人：西安桑尼赛尔生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：