【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】工程化的现成免疫细胞及其使用方法
技术背景
[0001]本申请要求于2019年6月12日提交的美国临时专利申请号62/860,613；于2019年6月12日提交的美国临时专利申请号62/860,644；于2019年6月12日提交的美国临时专利申请号62/860,667；于2019年12月11日提交的美国临时专利申请号62/946,747；和于2019年12月11日提交的美国临时专利申请好62/946,788的权益；其整体通过引用明确并入本文中。
1.
[0002]本公开内容的实施方案至少涉及免疫学、细胞生物学、分子生物学和医学的领域，至少包括癌症医学。
[0003]2.相关技术说明
[0004]癌症影响全世界数千万的人并且是美国公共卫生的主要威胁。虽然现有疗法，但是癌症患者仍然遭受这些治疗的无效、它们的毒性和复发风险。因此，迫切需要新的癌症疗法。在过去十年中，免疫疗法已经成为新一代的癌症药物。特别地，基于细胞的细胞疗法已经显示出巨大的希望。突出的实例是嵌合抗原受体(CAR)工程化的过继T细胞疗法，它以令人印象深刻的功效针对某些血癌。
[0005]然而，大多数当前的治疗协议由自体过继细胞转移组成，其中从患者中收集的免疫细胞被制造并且用于治疗该单个患者。此种方法成本高、制造劳动强度大，并且难以广泛提供给所有有需要的患者。因此，对可以大规模制造并且可以容易分布以治疗更多患者的同种异体免疫细胞产品的需求很大。
[0006]虽然现有疗法，癌症患者仍然遭受这些治疗的无效、它们的毒性和复发风险。因此，
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于制备T细胞群的方法，其包括：a)选择干细胞或祖细胞；b)引入一种或更多种编码至少一种T细胞受体(TCR)的核酸；以及c)培养所述细胞以诱导所述细胞分化为T细胞；其中a)、b)和/或c)不包括使所述细胞与饲养细胞或饲养细胞群接触。2.根据权利要求1所述的方法，其中c)包括无饲养物的培养物。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述干细胞或祖细胞包含CD34+细胞。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的方法，其中在包含IL
‑
3、IL
‑
7、IL
‑
6、SCF、MCP
‑
4、EPO、TPO、FLT3L和/或retronection中的一种或更多种的培养基中培养a)中的所述细胞。5.根据权利要求4所述的方法，其中在用retronection、DLL4、DLL1和/或VCAM1包被的表面上培养所述细胞。6.根据权利要求5所述的方法，其中在包含5
‑
50ng/ml hIL
‑
3、5
‑
50ng/ml IL
‑
7、0.5
‑
5ng/ml MCP
‑
4、IL
‑
6、5
‑
50ng/ml hSCF、EPO、5
‑
50ng/ml hTPO和/或10
‑
100ng/ml hFLT3L中的一种或更多种的培养基中培养a)中的所述细胞。7.根据权利要求6所述的方法，其中在包含10ng/ml hIL
‑
3、20
‑
25ng/ml IL
‑
7、1ng/ml MCP
‑
4、IL
‑
6、15
‑
50ng/ml hSCF、EPO、5
‑
50ng/ml hTPO和/或50ng/ml hFLT3L中一种或更多种的培养基中培养a)中的所述细胞。8.根据权利要求4或5所述的方法，其中将a)中的所述细胞与IL
‑
3、IL
‑
7、IL
‑
6、SCF、EPO、TPO、FLT3L和/或retronection中的一种或更多种一起培养12
‑
72小时。9.根据权利要求1
‑
8中任一项所述的方法，其中所述TCR包含iNKT TCR。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述iNKT TCR特异性结合α
‑
GC。11.根据权利要求1
‑
8中任一项所述的方法，其中所述TCR包含特异性识别所述NY
‑
ESO
‑
1抗原的TCR。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述NY
‑
ESO
‑
1抗原包含NY
‑
ESO
‑1157
‑
165
。13.根据权利要求1
‑
12中任一项所述的方法，其中c)包括在分化和/或扩增培养基中培养所述细胞。14.根据权利要求1
‑
13中任一项所述的方法，其中c)包括使所述细胞与DLL1、DLL4、VCAM1、VCAM5和/或retronection中的一种或更多种接触。15.根据权利要求14所述的方法，其中DLL1、DLL4、VCAM1、VCAM5和/或retronection中的一种或更多种包被在组织培养板或微珠表面上。16.根据权利要求15所述的方法，其中使用包含0.1
‑
10μg/ml DLL4和0.01
‑
1μg/ml VCAM1的包被组合物将DLL1、DLL4、VCAM1、VCAM5和/或retronection中的一种或更多种包被在组织培养板上。17.根据权利要求16所述的方法，其中使用包含0.5μg/ml DLL4和0.1μg/ml VCAM1的包被组合物包被DLL1、DLL4、VCAM1、VCAM5和/或retronection中的一种或更多种。18.根据权利要求13
‑
17中任一项所述的方法，其中所述扩增或分化培养基包含Iscove
’
s MDM、血清白蛋白、胰岛素、转铁蛋白和/或2
‑
巯基乙醇中的一种或更多种。19.根据权利要求13
‑
17中任一项所述的方法，其中所述扩增或分化培养基包含抗坏血酸、人血清、B27补充剂、glutamax、Flt3L、IL
‑
7、MCP
‑
4、IL
‑
6、TPO和SCF中的一种或更多种。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述扩增或分化培养基包含50
‑
500μM抗坏血酸、人血清、1％
‑
10％B27补充剂、0.1％
‑
10％glutamax、2
‑
50ng/ml Flt3L、2
‑
50ng/ml IL
‑
7、0.1
‑
1ng/ml MCP
‑
4、0
‑
10ng/ml IL
‑
6、0.5
‑
50ng/ml TPO和1.5
‑
50ng/ml SCF中的一种或更多种。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述扩增或分化培养基包含100μM抗坏血酸、人血清、4％B27补充剂、1％glutamax、2
‑
50ng/ml Flt3L、2
‑
50ng/ml IL
‑
7、0.1
‑
1ng/ml MCP
‑
4、0
‑
10ng/ml IL
‑
6、0.5
‑
50ng/ml TPO和1.5
‑
50ng/ml SCF中的一种或更多种。22.根据权利要求1
‑
21中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括刺激和/或扩增所述细胞。23.根据权利要求22所述的方法，其中刺激和/或扩增所述细胞包括使所述细胞与特异性结合TCR的抗原接触。24.根据权利要求22或23所述的方法，其中刺激和/或扩增所述细胞包括使所述细胞与抗CD3抗体、抗CD2抗体和/或抗CD28抗体或其抗原结合片段接触。25.根据权利要求22
‑
24中任一项所述的方法，其中刺激和/或扩增所述细胞包括在扩增培养基中培养所述细胞。26.根据权利要求22
‑
25中任一项所述的方法，其中所述方法包括通过使所述细胞与α
‑
GC接触来刺激和/或扩增所述细胞。27.根据权利要求1
‑
26中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括使所述细胞与IL
‑
15和IL
‑
7之一或二者接触和/或其中所述扩增培养基包含IL
‑
15或IL
‑
7之一或二者。28.根据权利要求27所述的方法，其中所述扩增培养基包含5
‑
100ng/ml IL
‑
7和/或5
‑
100ng/ml IL
‑
15。29.根据权利要求28所述的方法，其中所述扩增培养基包含10ng/ml IL
‑
7和/或50ng/ml IL
‑
15。30.根据权利要求1
‑
29中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括使所述细胞与人血清抗体、Glutamax、缓冲液、抗微生物剂和N
‑
乙酰基
‑
L
‑
半胱氨酸中的一种或更多种接触；和/或其中所述扩增培养基包含人血清抗体、Glutamax、缓冲液、抗微生物剂和N
‑
乙酰基
‑
L
‑
半胱氨酸中的一种或更多种。31.根据权利要求1
‑
30中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括通过使所述细胞与抗CD3和/或抗CD28包被的珠接触来活化所述细胞。32.根据权利要求1
‑
31中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括将包含CAR分子和/或HLA
‑
E基因的核酸转移到所述细胞中。33.根据权利要求32所述的方法，其中通过逆转录病毒感染将包含CAR分子和/或HLA
‑
E基因的所述核酸转移到所述细胞中。34.根据权利要求1
‑
33中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括使所述细胞与retronection接触。35.根据权利要求1
‑
34中任一项所述的方法，其中所述细胞是从健康受试者和/或未患有癌症的受试者中分离的。36.根据权利要求1
‑
35中任一项所述的方法，其中a、b、c或整个所述方法不包括使所述细胞与饲养细胞群接触。
37.根据权利要求1
‑
36中任一项所述的方法，其中a、b、c或整个所述方法不包括使所述细胞与基质细胞群接触。38.根据权利要求1
‑
37中任一项所述的方法，其中a、b、c或整个所述方法不包括使所述细胞与notch配体或其片段接触。39.根据权利要求1
‑
38中任一项所述的方法，其中所述细胞是来自包含分化的造血细胞的群的CD34+细胞。40.根据权利要求39所述的方法，其中所述分化的造血细胞是外周血单核细胞(PBMC)。41.根据权利要求1
‑
38中任一项所述的方法，其中所述干细胞或祖细胞包含脐带血细胞、胎肝细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞或骨髓细胞。42.根据权利要求3
‑
41中任一项所述的方法，其进一步包括分离CD34+细胞。43.根据权利要求3
‑
42中任一项所述的方法，其进一步包括在将一种或更多种核酸引入所述细胞之前在培养基中培养所述所选择的CD34+细胞。44.根据权利要求43所述的方法，其中培养包括将所述所选择的CD34+细胞与包含一种或更多种生长因子的培养基一起孵育。45.根据权利要求44所述的方法，其中所述一种或更多种生长因子包含c
‑
kit配体、flt
‑
3配体和/或人血小板生成素(TPO)。46.根据权利要求1
‑
45中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种核酸中的核酸包含编码α
‑
TCR的核酸序列。47.根据权利要求1
‑
46中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种核酸中的核酸包含编码β
‑
TCR的核酸序列。48.根据权利要求1
‑
47中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种核酸中的核酸包含编码α
‑
TCR和β
‑
TCR二者的核酸。49.根据权利要求1
‑
48中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种核酸中的第一核酸包含编码α
‑
TCR的核酸序列并且所述一种或更多种核酸中的第二核酸包含编码β
‑
TCR的核酸序列。50.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括将编码自杀基因的核酸引入所述所选择的CD34+细胞中。51.根据权利要求50所述的方法，其中一种核酸编码α
‑
TCR和β
‑
TCR二者。52.根据权利要求51所述的方法，其中一种核酸编码所述α
‑
TCR、β
‑
TCR和自杀基因。53.根据权利要求50
‑
52中任一项所述的方法，其中所述自杀基因是基于酶的。54.根据权利要求53所述的方法，其中所述自杀基因编码胸苷激酶(TK)或诱导型半胱天冬酶9。55.根据权利要求54所述的方法，其中所述TK基因是病毒TK基因。56.根据权利要求54所述的方法，其中所述TK基因是单纯疱疹病毒TK基因。57.根据权利要求50
‑
56中任一项所述的方法，其中所述自杀基因产物通过底物活化。58.根据权利要求57所述的方法，其中所述底物是更昔洛韦、喷昔洛韦或其衍生物。59.根据权利要求58所述的方法，其中所述自杀基因产物是具有可以被标记用于成像的底物的多肽。60.根据权利要求56
‑
59中任一项所述的方法，其中所述自杀基因是sr39TK。
61.根据权利要求1
‑
60中任一项所述的方法，其中所述T细胞的基因组被改变以通过破坏编码β
‑2‑
微球蛋白(B2M)、主要组织相容性复合体II反式活化因子(CIITA)和/或单个HLA
‑
I和HLA
‑
II分子的基因的表达来消除至少一种HLA
‑
I或HLA
‑
II分子的表面表达。62.根据权利要求61所述的方法，其中在分离的人CD34+细胞中消除细胞表面HLA
‑
I和/或HLA
‑
II分子的表达包括将CRISPR和一种或更多种对应于B2M、CIITA和/或单个HLA
‑
I和HLA
‑
II分子的指导RNA(gRNA)进入所述细胞中。63.根据权利要求62所述的方法，其中通过电穿孔或脂质介导的转染将CRISPR或所述一种或更多种gRNA转染到所述细胞中。64.根据权利要求1
‑
63中任一项所述的方法，其中使用重组载体将编码TCR受体的所述核酸引入所述细胞中。65.根据权利要求64所述的方法群，其中所述重组载体是病毒载体。66.根据权利要求65所述的方法，其中所述病毒载体是慢病毒、逆转录病毒、腺相关病毒(AAV)、疱疹病毒或腺病毒。67.根据权利要求66所述的方法，其中所述病毒载体是慢病毒。68.根据权利要求1
‑
67中任一项所述的方法，其中选择缺乏HLA
‑
I/II分子表面表达的T细胞包括使用微珠或流式细胞术对T细胞进行阳性选择和对HLA
‑
I/II阴性细胞进行阴性选择。69.根据权利要求1
‑
68中任一项所述的方法，其中所述T细胞是经冷冻的。70.根据权利要求1
‑
69中任一项所述的方法，其中所述T细胞不表达内源性TCR。71.根据权利要求1
‑
70中任一项所述的方法，其中所述方法产生包含至少约102‑
106个工程化T细胞的工程化T细胞群。72.根据权利要求1
‑
71中任一项所述的方法，其中所述方法产生包含至少约106‑
10
12
个工程化T细胞的细胞群。73.根据权利要求1
‑
72中任一项所述的方法，其中将所述T细胞群冷冻并然后解冻。74.根据权利要求73所述的方法，其进一步包括将一种或更多种另外的核酸引入所述经冷冻和解冻的细胞群中。75.根据权利要求74所述的方法，其中所述一种或更多种另外的核酸编码TCR或CAR之一或二者。76.根据权利要求75所述的方法，其中所述TCR或CAR包含肿瘤抗原特异性TCR或CAR。77.根据权利要求76所述的方法，其中所述CAR对BCMA、CD19、CD20或NY
‑
ESO具有特异性。78.根据权利要求1
‑
77中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种核酸编码所述至少一种TCR和IL
‑
15。79.根据权利要求78所述的方法，其中所述一种或更多种核酸进一步编码CAR。80.通过根据权利要求1
‑
79中任一项所述的方法产生的细胞或细胞群。81.工程化不变自然杀伤T(iNKT)细胞，其表达至少一种不变自然杀伤(iNKT)T细胞受体(TCR)，并且其中所述细胞包含以下中的一种或更多种：高水平NKG2D；低或检测不到的KIR的表达；和
高水平颗粒酶B。82.工程化T细胞，其表达至少一种外源性T细胞受体(TCR)，并且其中所述细胞包含以下中的一种或更多种：高水平NKG2D；低或检测不到的KIR的表达；和高水平颗粒酶B。83.工程化iNKT细胞群，其表达至少一种iNKT TCR，并且其中所述细胞群包含以下中的一种或更多种：至少50％的具有高水平NKG2D的细胞；少于20％的具有高水平KIR的细胞；和至少50％的具有高水平颗粒酶B的细胞。84.工程化T细胞群，其表达至少一种外源性TCR，并且其中所述细胞群包含以下中的一种或更多种：至少50％的具有高水平NKG2D的细胞；少于20％的具有高水平KIR的细胞；和至少50％的具有高水平颗粒酶B的细胞。85.根据权利要求81
‑
84中任一项所述的工程化细胞，其中至少一种不变TCR基因产物通过外源性核酸表达。86.根据权利要求81
‑
85中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞未经历细胞分选。87.根据权利要求82
‑
86中任一项所述的工程化细胞，其中至少10％的所述细胞包含高表达的IFN
‑
γ。88.根据权利要求81
‑
87中任一项所述的工程化细胞，其中(1)所述细胞包含外源性自杀基因；或(2)所述细胞的基因组被改变以消除至少一种HLA
‑
I或HLA
‑
II分子的表面表达，其中所述至少一种TCR通过在经重组修饰的启动子区域的转录控制下的外源性核酸和/或内源不变TCR基因表达。89.根据权利要求81
‑
88中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞源自健康受试者的造血干细胞。90.根据权利要求81
‑
89中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞源自非癌性受试者的造血干细胞。91.根据权利要求82
‑
90中任一项所述的工程化细胞，其中所述TCR的氨基酸序列在至少95％的细胞中是相同的。92.根据权利要求81
‑
91中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞进一步包含嵌合抗原受体(CAR)。93.根据权利要求92所述的工程化细胞，其中所述CAR特异性结合BCMA。94.根据权利要求81
‑
93中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞进一步包含HLA
‑
E的外源表达。95.根据权利要求81
‑
94中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞进一步包含编码多肽的外源性核酸，所述多肽包含自杀基因、HLA
‑
E、CAR和/或TCR的全部或片段。96.根据权利要求88
‑
95中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞的基因组被改变以
消除至少一种HLA
‑
I或HLA
‑
II分子的表面表达。97.根据权利要求81
‑
96中任一项所述的工程化细胞，其中所述不变TCR基因产物是αTCR基因产物。98.根据权利要求81
‑
97中任一项所述的工程化细胞，其中所述不变TCR基因产物是βTCR基因产物。99.根据权利要求81
‑
98中任一项所述的工程化细胞，其中表达αTCR基因产物和βTCR基因产物二者。100.根据权利要求88
‑
99中任一项所述的工程化细胞，其中所述外源性自杀基因或HLA
‑
E基因和/或所述外源性核酸具有一个或更多个在细胞中优化来用于表达的密码子。101.根据权利要求88
‑
99中任一项所述的工程化细胞，其中所述自杀基因产物是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV
‑
TK)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、胞嘧啶脱氨酶(CD)、羧肽酶G2、细胞色素P450、亚麻苦苷酶、β
‑
内酰胺酶、硝基还原酶(NTR)、羧肽酶A或诱导型半胱天冬酶9。102.根据权利要求88
‑
101中任一项所述的工程化细胞，其中所述自杀基因是基于酶的。103.根据权利要求102所述的工程化细胞，其中所述自杀基因编码胸苷激酶(TK)或诱导型半胱天冬酶9。104.根据权利要求103所述的工程化细胞，其中所述TK基因是病毒TK基因。105.根据权利要求104所述的工程化细胞，其中所述TK基因是单纯疱疹病毒TK基因。106.根据权利要求81
‑
105中任一项所述的工程化细胞，其中所述自杀基因通过底物活化。107.根据权利要求106所述的工程化细胞，其中所述底物是更昔洛韦、喷昔洛韦或其衍生物。108.根据权利要求107所述的工程化细胞，其中所述自杀基因产物是具有可以被标记用于成像的底物的多肽。109.根据权利要求81
‑
108中任一项所述的工程化细胞，其中所述自杀基因是sr39TK或诱导型半胱天冬酶9。110.根据权利要求81
‑
109中任一项所述的工程化细胞，其中所述TCR特异性结合α
‑
半乳糖苷神经酰胺(α
‑
GC)。111.根据权利要求81
‑
110中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞的基因组被改变以通过破坏编码β
‑2‑
微球蛋白(B2M)、主要组织相容性复合体II反式活化因子(CIITA)和/或单个HLA
‑
I和HLA
‑
II分子的基因的表达来消除至少一种HLA
‑
I或HLA
‑
II分子的表面表达。112.根据权利要求111所述的工程化细胞，其中由于基因编辑，所述HLA
‑
I或HLA
‑
II不在所述细胞的表面上表达。113.根据权利要求112所述的工程化细胞，其中所述基因编辑涉及CRISPR
‑
Cas9。114.根据权利要求81
‑
113中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞包含来自被引入所述细胞中的重组载体的核酸。115.根据权利要求114所述的工程化细胞，其中所述核酸被整合到所述细胞的基因组中。116.根据权利要求114或115所述的工程化细胞，其中所述重组载体是病毒载体。
117.根据权利要求116所述的工程化细胞，其中所述病毒载体包含慢病毒、逆转录病毒、腺相关病毒(AAV)、疱疹病毒或腺病毒。118.根据权利要求81
‑
117中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞未暴露于包含非人血清的培养基或其中所述细胞未被非人血清污染。119.根据权利要求81
‑
118中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞是经冷冻的。120.根据权利要求81
‑
118中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞之前被冷冻并且其中所述细胞在室温下稳定至少1小时。121.根据权利要求81
‑
120中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞源自造血干细胞。122.根据权利要求121所述的工程化细胞，其中所述细胞源自G
‑
CSF动员CD34+细胞。123.根据权利要求81
‑
122中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞不表达内源性TCR。124.根据权利要求83
‑
123中任一项所述的工程化细胞，其中超过70％的所述细胞是工程化细胞。125.根据权利要求124所述的工程化细胞，其中超过80％的所述细胞是工程化细胞。126.根据权利要求125所述的工程化细胞，其中超过90％的所述细胞是工程化细胞。127.根据权利要求126所述的工程化细胞，其中超过95％的所述细胞是工程化细胞。128.根据权利要求127所述的工程化细胞，其中超过99％的所述细胞是工程化细胞。129.根据权利要求83
‑
128中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞群是至少约106‑
10
12
个工程化细胞。130.根据权利要求129所述的工程化细胞，其中所述细胞是经冷冻的。131.一种用T细胞治疗患者的方法，其包括向患者施用根据权利要求80
‑
130中任一项所述的细胞。132.根据权利要求131所述的方法，其中所述患者患有癌症。133.根据权利要求132所述的方法，其中所述癌症包括多发性骨髓瘤。134.根据权利要求132所述的方法，其中所述癌症包括白血病。135.根据权利要求131所述的方法，其中所述患者患有涉及炎症的疾病或病症。136.根据权利要求135所述的方法，其中所述疾病或病症是自身免疫病。137.根据权利要求135所述的方法，其中所述疾病或病症是移植物抗宿主病(GVHD)。138.根据权利要求131
‑
137中任一项所述的方法，其中所述细胞或细胞群对于所述患者是同种异体的。139.根据权利要求131
‑
138中任一项所述的方法，其中所述患者没有表现出所述细胞或细胞群完全耗尽的迹象。140.根据权利要求131
‑
139中任一项所述的方法，其进一步包括向所述患者施用引发所述自杀基因产物的化合物。141.根据权利要求140所述的方法，其中在向所述患者施用所述细胞或细胞群之后，所述患者的肿瘤进展被控制或抑制。142.根据权利要求140或141中任一项所述的方法，其中炎症减轻。143.一种用于在患者中治疗癌症的方法，其包括施用根据权利要求80
‑
130中任一项所
述的细胞。144.工程化不变自然杀伤T(iNKT)细胞，其表达至少一种不变自然杀伤(iNKT)T细胞受体(TCR)和嵌合抗原受体(CAR)，其包含：1.a)胞外结合结构域；2.b)单个跨膜结构域；和3.c)包含初级胞内信号传导结构域的单个细胞质区域，4.其中所述至少一种iNKT TCR通过在经重组修饰的启动子区域的转录控...
【专利技术属性】
技术研发人员：L杨，P王，YJ金，J于，Y李，
申请(专利权)人：南加州大学，
类型：发明
国别省市：
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