一种以工程化红细胞作为滋养层细胞体外高效扩增NK细胞的方法技术

一种以工程化红细胞作为滋养层细胞体外高效扩增NK细胞的方法，属于细胞基因治疗领域，包括使用低浓度戊二醛醛化红细胞表面蛋白，并在红细胞表面标记多种不同蛋白组合，包括IL

【技术实现步骤摘要】
一种以工程化红细胞作为滋养层细胞体外高效扩增NK细胞的方法


[0001]本专利技术属于生物医药领域，尤其属于细胞基因治疗领域。

技术介绍

[0002]自然杀伤细胞（Natural Killer Cell NK）细胞的主要特征是不需预先刺激就可直接溶解破坏肿瘤细胞和病毒感染细胞，通过分泌穿孔素、丝氨酸蛋白酶如颗粒酶A和B、硫酸软骨素蛋白聚糖等分子降解细胞膜、破坏靶细胞完整性而发挥溶细胞效应，其对不表达MHC分子的肿瘤细胞杀伤效果好，NK细胞在人外周血含量很少（5
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10%），需要在体外大规模扩增NK细胞以为基础研究和临床应用研究使用NK细胞提供了一个有力的工具。目前使用得NK细胞体外大规模扩增方法可以分为“滋养层方法”和“因子法”，滋养层方法多采用以白血病细胞系K562细胞转入IL
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15以及41
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BB基因，细胞经过辐照后作为滋养层细胞用于NK细胞的培养。因子法以her
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2单抗 IL
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15 以及IL
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12等方法在体外高效诱导NK细胞扩增。目前两种方法都存在一些问题影响了临床大规模NK细胞细胞推广应用。滋养层方法因为使用肿瘤细胞系K562细胞作为滋养层细胞，且细胞经过转基因处理，虽然处理后K562细胞失去扩增活性，但保留了分泌因子的能力，临床使用安全性方面需要经过更多的验证，另外，滋养层细胞的状态直接对NK细胞培养的效果有决定性的影响。因子法使用简单，但存在着受样本个体差异影响的问题，无法在所有样本中得到稳定一致的NK细胞扩增的得率和纯度。

技术实现思路

[0003]本专利技术提供一种以工程化红细胞作为滋养层细胞体外高效扩增NK细胞的方法，用以解决现有技术中的缺陷。
[0004]本专利技术通过以下技术方案予以实现：一种用于体外高效扩增NK细胞的工程化红细胞滋养层细胞，其特征在于：使用红细胞表面修饰IL
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15,4
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1BB，CD335单抗以及 CD2单抗等蛋白形成工程化红细胞，工程化红细胞滋养层细胞可以用于反复刺激PBMC在体外获得大量高纯度NK细胞。
[0005]工程化红细胞表面修饰的蛋白组合有IL
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15,4
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1BB，CD335单抗以及 CD2单抗,其通过以下方法制得：步骤一：新鲜红细胞使用0.025%戊二醛室温震荡作用45min；步骤二：用PBS溶液300g 8min离心洗涤后分别用10μg/ml CD335单抗，10μg/ml IL
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15、5μg/ml CD2单抗以及10μg/ml 4
‑
1BB反应2小时；步骤三：使用PBS溶液 300g 8min洗涤后获得工程化红细胞，工程化红细胞滋养层细胞保存于2
‑8°
环境。
[0006]工程化红细胞滋养层细胞，可以用于反复刺激PBMC在体外获得大量高纯度NK细胞其具体使用方法如下：步骤一：从脐血和外周血中获得单个核细胞，按工程化红细胞滋养层细胞/MNC 2：
1的比例铺瓶培养；步骤二：隔天补加新鲜培养液，培养第7天按工程化红细胞滋养层细胞/MNC 2：1的比例再次刺激所培养目的细胞；步骤三：隔天补液，培养第14
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15天收获目的细胞。
[0007]本专利技术的优点是：我们使用戊二醛醛化红细胞表面蛋白，并可在红细胞表面标记多种不同蛋白组合，包括IL
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15,4
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1BB，CD335单抗以及 CD2单抗等，使用工程化红细胞作为滋养层细胞在体外反复刺激PBMC并使之产生大量NK细胞，本专利技术避免了K562等肿瘤细胞系的使用能够确保NK细胞制备过程更加安全进，同事使用工程化红细胞反复刺激能够在体外获得大量高杀伤活性NK细胞，制备安全足量的NK细胞能够更加符合临床使用需求。
附图说明
[0008]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0009]图1是本专利技术的工程化红细胞滋养层细胞制备流程示意图；图2是本专利技术的体外NK细胞高效扩增过程示意图；图3是本专利技术的体外高效扩增NK细胞纯度流式图；图4是本专利技术的体外高效扩增NK细胞增殖倍数图。
具体实施方式
[0010]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0011]实施例1体外高效扩增NK细胞的工程化红细胞滋养层细胞制备：步骤一：新鲜红细胞使用0.025%戊二醛室温震荡作用45min；步骤二：用PBS溶液300g 8min离心洗涤后分别用10μg/ml CD335单抗，10μg/ml IL
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15、5μg/ml CD2单抗以及10μg/ml 4
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1BB反应2小时；步骤三：使用PBS溶液 300g 8min洗涤后获得工程化红细胞，工程化红细胞滋养层细胞保存于2
‑8°
环境。
[0012]实施例2体外高效扩增NK细胞的工程化红细胞滋养层细胞反复刺激PBMC在体外获得大量高纯度NK细胞其具体使用方法如下：步骤一：从脐血和外周血中获得单个核细胞，培养第一天按工程化红细胞滋养层细胞/MNC 2：1的比例铺瓶培养；步骤二：隔天补加新鲜培养液（含IL
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2 500U/ml），培养第7天按工程化红细胞滋养层细胞/MNC 2：1的比例再次刺激所培养目的细胞；步骤三：隔天补加新鲜培养液（含IL
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2 500U/ml），培养第14
‑
15天收获目的细胞。
[0013]最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本专利技术的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本专利技术进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本专利技术各实施例技术方案的精神和范围。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种以工程化红细胞作为滋养层细胞体外高效扩增NK细胞的方法，其特征在于：使用红细胞表面修饰IL
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1BB，CD335单抗以及 CD2单抗等蛋白形成工程化红细胞滋养层细胞，工程化红细胞滋养层细胞可以用于反复刺激PBMC在体外获得大量高纯度NK细胞。2.根据权利要求1所述的一种用于体外高效扩增NK细胞的工程化红细胞滋养层细胞，其特征在于：工程化红细胞表面修饰的蛋白组合有IL
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1BB，CD335单抗以及 CD2单抗。3.根据权利要求1所述的一种用于体外高效扩增NK细胞的工程化红细胞滋养层细胞，其特征在于：工程化红细胞使用低浓度戊二醛醛化，表面修饰的蛋白组合有IL
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1BB，CD335单抗以及 CD2单抗,其通过以下方法制得：步骤一：新鲜红细胞使用0.0...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄能平，叶永清，杨丽秋，
申请(专利权)人：厦门三一造血技术有限公司，
类型：发明
国别省市：