一种高效稳定表达激活型抗体的CAR-T细胞及其用途制造技术

本发明专利技术提供一种高效稳定表达激活型抗体的CAR

【技术实现步骤摘要】
一种高效稳定表达激活型抗体的CAR
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T细胞及其用途
[0001]本专利技术专利申请为申请号为CN 201610445661.4、申请日为2016年6月20日、专利技术名称为“一种高效稳定表达激活型抗体的CAR
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T细胞及其用途”的专利技术专利申请的分案申请。


[0002]本专利技术属于细胞生物学和肿瘤学领域，涉及一种高效稳定表达激活型抗体的CAR
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T细胞及其用途。

技术介绍

[0003]针对恶性肿瘤的免疫治疗近年来发展迅速，取得令人瞩目的临床疗效。其中，免疫检查点(如CTLA4、PD1/PDL1)单抗治疗，通过原位激活患者残留的肿瘤特异性T细胞发挥作用，对多种恶性肿瘤的总体有效率达到30％，且许多患者一旦起效能长期存活；转基因CAR
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T/TCR
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T细胞治疗，是通过离体基因修饰的手段快速获得肿瘤特异性T细胞后，过继回输进行治疗发挥作用，对复发难治性B细胞白血病的完全缓解率超过90％。
[0004]嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor,CAR)一般由一个scFv(single
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chain variable Fragment)单链抗体(抗体轻重链可变区经Linker连接构成，负责结合膜抗原)，通过铰链结构(负责形成正确构象，形成二聚体)与跨膜区、胞内信号结构(负责传递T细胞活化信号)连接构成。经CAR基因修饰的T细胞(CAR
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T)被赋予识别肿瘤细胞膜抗原肽分子，启动杀伤或增殖的能力。由于CAR
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T细胞识别的是表达在细胞膜上的抗原，而非与MHC分子结合后被递呈到细胞表面的抗原，因而可以绕过T细胞MHC限制性，避免由于肿瘤细胞下调或缺失MHC分子引起的免疫逃逸。
[0005]CAR的设计最早由以色列学者Eshhar和其同事于1989年提出，按其发展阶段到目前为止可分为三代。第一代CAR受体包含了胞外特异识别肿瘤抗原的svFC片段，胞内激活信号由CD3ζ或FcεRIγ的ITAM(immunoreceptor tyrosine
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based activation motifs)信号链来传递。但是第一代CAR受体缺乏T细胞的共刺激信号，导致T细胞只能发挥瞬间效应，在体内存在时间短、细胞因子分泌少等缺点。第二代CAR受体增加了共刺激信号分子的胞内结构域，包括如CD28，CD134/OX40，CD137/4
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1BB，lymphocyte
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specific protein tyrosine kinase(LCK)，inducible T
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cell co
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stimulator(ICOS)以及DNAX
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activation protein 10(DAP10)等结构域，增强了T细胞的增殖能力及细胞因子的分泌功能，IL
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2、IFN
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γ以及GM
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CSF增加，从而突破肿瘤微环境的免疫抑制、延长AICD(activation induced cell death,AICD)。第三代CAR受体则是在第二代CAR的基础上再融合一个二级共刺激分子如4
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1BB，从而产生一个三重信号的CAR受体，第三代CAR受体改造的T细胞具有更好的效应功能和体内存活时间。近年来，有部分学者提出第四代CAR受体概念，他们在第三代CAR的基础上增加了IL12、IL15等具有正向调节T细胞功能的细胞因子，进一步提高T细胞的增殖、杀伤、体内存活能力。
[0006]目前，已有多个靶标的CAR
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T细胞正在开展实体瘤治疗的临床试验，包括GD2、FR
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α、L1
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CAM、HER2、EGFR、EGFRvIII、VEGFR
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2、IL
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13Rα2、FAP、Mesothelin、c
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MET、PSMA、CEA、GPC3、EphA2、MUC1、CAIX(carbonic anhydrase IX)等。其中，部分临床试验取得相对良好的结果，例如，针对GD2的CAR
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T细胞治疗高风险性神经母细胞瘤的临床试验(19例患者)，8例患者回输后肿瘤完全消退，3例未消退的患者在回输后第6周的观察时间点显示完全应答，1名完全应答患者192周仍能检测到CAR
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T细胞；针对HER2的CAR
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T细胞治疗HER2阳性实体瘤临床试验(共19例，其中骨肉瘤16例)，4例维持无疾病进展状态12周至14月，其中3例肿瘤消退，1例消退90％以上。然而总体而言，实体瘤的CAR
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T治疗相对于血液肿瘤，疗效仍存在较大差距，究其原因，主要包括：
[0007]1、抑制免疫的微环境
[0008]实体瘤组织存在免疫抑制的微环境，包括Treg细胞、肿瘤相关成纤维细胞、骨髓来源未成熟DC细胞、M2型巨噬细胞等及其它们分泌的细胞因子，如IL
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6、IL
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10、IDO、VEGF、TGFβ等，这些细胞及其分泌的细胞因子可以通过直接或间接的方式抑制T细胞的功能。通过放化疗破坏肿瘤微环境，免疫检查点抗体(如PD1/PDL1)或免疫负调节因子(如IDO小分子抑制剂)特异阻断相关信号通路，表观遗传修饰相关酶类的抑制剂整体调整免疫微环境，过表达免疫正调节因子(如IL
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12)，直接靶向清除肿瘤基质细胞(如靶向FAP阳性肿瘤相关成纤维细胞的CAR
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T)等策略，均可以作用于实体瘤免疫抑制的微环境，提高浸润的CAR
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T细胞的存活能力与杀伤效果。
[0009]2、缺乏合适的CAR
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T治疗靶点
[0010]实体瘤具有高度的异质性，不同患者、同一患者不同病灶、同一病灶不同肿瘤细胞之间均存在高度的差异。这种高度的异质性致使肿瘤靶向治疗陷入缺乏理想的通用、广谱靶点的不利境地，限制了CAR
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T细胞治疗实体瘤的疗效。因而，为扩大CAR
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T细胞的杀伤范围，有学者提出TanCAR的设计理念，将两种结合不同肿瘤相关抗原的scFv串联在一起，构成一个新的能同时识别并结合两个靶点的CAR，有效提高了CAR
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T细胞的疗效。
[0011]3、在体内难以达到有效数量
[0012]T细胞杀伤肿瘤细胞必需群集效应，杀伤一个肿瘤细胞需要数个T细胞的协作，因而只有效应细胞达到一定数量后，肿瘤细胞才可被有效杀伤。所以，当T细胞接触特定靶点的肿瘤细胞后，可快速增殖，并通过直接接触与旁分泌途径，放大杀伤功能。CAR
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T细胞通过静脉给药，在血液肿瘤条件下，非常容易接触肿瘤细胞，CAR
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T细胞的数量可快速本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种转基因T细胞，其特征在于，所述T细胞基因组中稳定整合了含编码嵌合抗原受体，及针对CD28的激活型抗体的核酸序列的表达框，且表达框的两端包含转座子的反向末端重复序列；其中，所述嵌合抗原受体是针对EGFR家族的嵌合抗原受体，所述针对CD28的激活型抗体为膜锚定型抗体。2.如权利要求1所述的转基因T细胞，其特征在于，所述转座子选自：piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5和Ty。3.如权利要求2所述的转基因T细胞，其特征在于，所述转座子为piggybac。4.如权利要求1所述的转基因T细胞，其特征在于，所述激活型抗体选自：抗体全长序列或其功能性片段。5.如权利要求4所述的转基因T细胞，其特征在于，所述激活型抗体选自：Fab、Fab
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、F(ab
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)2、Fv、scFv和scFv
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Fc。6.如权利要求1所述的转基因T细胞，其特征在于，激活型抗体为抗CD28抗体的scFv。7.如权利要求1所述的转基因T细胞，其特征在于，所述转基因T细胞还包含刹车分子。8.如权利要求7所述的转基因T细胞，其特征在于，该刹车分子为可被已上市抗体药物识别的膜抗原。9.如权利要求8所述的转基因T细胞，其特征在于，所述膜抗原选自CD11a、CD15、CD19、CD20、CD25、CD44、CD47、CD52、EGFR、ERBB2、ERBB3、ERBB4、VEGFR1、VEGFR2、EpCAM、MSLN、GPIIb/IIIa、α4整合素和α4β7整合素。10.如权利要求8所述的转基因T细胞，其特征在于，所述膜抗原为CD20。11.如权利要求1
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10中任一项所述的转基因T细胞，其特征在于，所述转基因T细胞转入了以下核酸构建物C：核酸构建物C：含有转座子5
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反向末端重复序列，编码任选的刹车分子、嵌合抗原受体和针对CD28的激活型抗体的核酸序列及控制该核酸序列表达的启动子，polyA加尾信号序列，转座子3
’
反向末端重复序列，转座酶编码序列和控制转座酶编码序列表达的启动子。12.如权利要求11所述的转基因T细胞，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱其军，金华君，胥阶英，李林芳，叶真龙，何周，江芏青，吴红平，
申请(专利权)人：上海细胞治疗集团有限公司，
类型：发明
国别省市：