提高β-2微球蛋白在HEK-293细胞中表达水平的细胞转染培养方法技术

本发明专利技术涉及重组蛋白领域，具体公开了一种提高β

【技术实现步骤摘要】
提高
β
‑
2微球蛋白在HEK
‑
293细胞中表达水平的细胞转染培养方法


[0001]本专利技术涉及重组蛋白领域，尤其是涉及一种提高β
‑
2微球蛋白在HEK
‑
293细胞中表达水平的细胞转染培养方法。

技术介绍

[0002]目前的蛋白来源一般包括两个方面，一方面是从动物组织中提取分离以及纯化得到的天然蛋白，另一方面则是通过质粒转染使得工程细胞携带有目的蛋白基因片段，再利用细胞培养表达目标蛋白，形成的重组蛋白。
[0003]由于重组蛋白的活性和纯度都比天然蛋白的高，而且更易吸收，安全性也更好，目前已经得到了越来越广泛的应用。
[0004]重组蛋白的生产流程主要为细胞转染和细胞培养，转染效率是保证产量的前提，但在保证产量的前提下，细胞的生长以及代谢需求会在整个表达周期中不断增大，从而容易导致营养物质以及生长因子大量被消耗，且有毒代谢产物同时会不断积累，导致细胞可能会产生程序性细胞凋亡，进而影响蛋白在宿主细胞中的表达水平。因此，仍有改进的空间。

技术实现思路

[0005]为了提高β
‑
2微球蛋白在HEK
‑
293细胞中的表达水平，本申请提供一种提高β
‑
2微球蛋白在HEK
‑
293细胞中表达水平的细胞转染培养方法。
[0006]本申请提供一种提高β
‑
2微球蛋白在HEK
‑
293细胞中表达水平的细胞转染培养方法，采用如下的技术方案：
[0007]一种提高β
‑
2微球蛋白在HEK
‑
293细胞中表达水平的细胞转染培养方法，包括以下步骤：
[0008]步骤1，取HEK
‑
293细胞稀释传代，保证活率≥90％，并取用密度为4
‑6×
106个/mL、存活率大于98％的细胞作为转染细胞；
[0009]步骤2，直接往转染细胞中兑入培养液，将细胞密度稀释成3
×
106个/mL，形成培养基，备用。
[0010]步骤3，取4
‑
6mL转染缓冲液与500
‑
505μL转染试剂混匀，形成转染溶液；另取4
‑
6mL转染缓冲液与100
‑
105μg HUMAN Beta
‑2‑
microglobulin无菌质粒DNA混匀，形成DNA溶液；
[0011]步骤4，混合转染溶液以及DNA溶液，轻轻混匀，并在室温下静置10
‑
12min，形成质粒
‑
载体复合溶液；
[0012]步骤5，将步骤4形成的质粒
‑
载体复合溶液逐滴滴加至步骤2制得的培养基中，并边滴加边轻轻摇动，滴加完成后，置于5％的CO2恒温摇床中，并于37℃以及135r/min的条件下震荡培养；
[0013]步骤6，培养24h后，添加100μL营养添加剂，并每间隔24h添加一次；
[0014]其中，所述培养液包括以下浓度的组分：
[0015]葡萄糖70
‑
80g/L；
[0016]酚红0.001
‑
0.005mg/L；
[0017]谷丙氨酸二肽150
‑
200mg/L；
[0018]维生素C 10
‑
15mg/L；
[0019]羟乙基哌嗪乙硫磺酸2.5
‑
3g/L；
[0020]碳酸氢钠100
‑
120mg/L；
[0021]肌醇500
‑
520mg/L；
[0022]氯化钙15
‑
18mg/L；
[0023]氯化钾300
‑
350mg/L；
[0024]氯化钠5
‑
7g/L；
[0025]L
‑
精氨酸450
‑
470mg/L；
[0026]L
‑
天冬氨酸60
‑
70mg/L；
[0027]L
‑
谷氨酸200
‑
230mg/L；
[0028]L
‑
组氨酸100
‑
110mg/L；
[0029]L
‑
异亮氨酸400
‑
420mg/L；
[0030]L
‑
赖氨酸450
‑
460mg/L；
[0031]L
‑
亮氨酸600
‑
620mg/L；
[0032]L
‑
缬氨酸450
‑
460mg/L；
[0033]L
‑
脯氨酸300
‑
310mg/L；
[0034]丙酮酸钠0.3
‑
0.8mL/L；
[0035]壳寡糖1
‑
4mg/L；
[0036]叶酸0.05
‑
0.2mg/L。
[0037]通过采用特定比例的碳水化合物、无机盐、维生素、微量元素、短肽以及氨基酸等种类的物质作为培养基的营养物质，有利于持续为细胞代谢提供充足的营养物质，从而有利于延长细胞表达周期，使得目的蛋白的表达水平更高；同时，将上述各营养物质维持在一个合适的浓度，还有利于更好地减少细胞代谢废物的产生，从而有利于降低有毒物质的积累，使得目的蛋白的表达时间延长，使得目的蛋白的表达水平更高；另外，通过加入丙酮酸钠、壳寡糖以及叶酸协同，还有利于更好地清除细胞在代谢过程中产生的有毒物质，使得细胞代谢有毒物质的积累减少，从而有利于为细胞的持续生长提供更好的环境，使得细胞密度可达到更大，进而有利于更好地延长目的蛋白的表达周期，使得目的蛋白的表达水平更高。
[0038]加入特定比例的羟乙基哌嗪乙硫磺酸以及碳酸氢钠，有利于更好地自动维持培养液的pH平衡，使得培养液在细胞生长以及表达的整个过程中始终处于适宜的pH，从而有利于更好地为细胞代谢以及生长提供更好的环境。
[0039]由于L
‑
谷氨酰胺在溶液中会发生降解，且同时又作为细胞代谢的重要能量来源，加入谷丙氨酸二肽，谷丙氨酸二肽在细胞代谢的过程中还会被裂解，并释放L
‑
谷氨酰胺，使得培养基无需加入L
‑
谷氨酰胺，有利于更好地提高培养液的稳定性，同时，还有利于培养液更好地为细胞代谢提供营养物质。
[0040]另外，上述特定的培养液配合特定的细胞密度，并在步骤2中直接用培养液稀释细胞密度，有利于更好地为细胞的生长提供足够的生长空间以及充足的营养物质，同时，稀释还不容易造成细胞死亡，不容易对活率造成影响，从而有利于更好地提高转染效本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高β
‑
2微球蛋白在HEK
‑
293细胞中表达水平的细胞转染培养方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1，取HEK
‑
293细胞稀释传代，保证活率≥90%，并取用密度为4
‑6×
106个/mL、存活率大于98%的细胞作为转染细胞；步骤2，直接往转染细胞中兑入培养液，将细胞密度稀释成3
×
106个/mL，形成培养基，备用；步骤3，取4
‑
6mL转染缓冲液与500
‑
505μL转染试剂混匀，形成转染溶液；另取4
‑
6mL转染缓冲液与100
‑
105μg HUMAN Beta
‑2‑
microglobulin无菌质粒DNA混匀，形成DNA溶液；步骤4，混合转染溶液以及DNA溶液，轻轻混匀，并在室温下静置10
‑
12min，形成质粒
‑
载体复合溶液；步骤5，将步骤4形成的质粒
‑
载体复合溶液逐滴滴加至步骤2制得的培养基中，并边滴加边轻轻摇动，滴加完成后，置于5%的CO2恒温摇床中，并于25
‑
37℃以及135r/min的条件下震荡培养；步骤6，培养24h后，添加100μL营养添加剂，并每间隔24h添加一次；其中，所述培养液包括以下浓度的组分：葡萄糖70
‑
80g/L；酚红0.001
‑
0.005mg/L；谷丙氨酸二肽150
‑
200mg/L；维生素C 10
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15mg/L；羟乙基哌嗪乙硫磺酸2.5
‑
3g/L；碳酸氢钠100
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120mg/L；肌醇500
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520mg/L；氯化钙15
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18mg/L；氯化钾300
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350mg/L；氯化钠5
‑
7g/L；L
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精氨酸450
‑
470mg/L；L
‑
天冬氨酸60
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70mg/L；L
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谷氨酸200
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230mg/L；L
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组氨酸100
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110mg/L；L
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异亮氨酸400
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420mg/L；L
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赖氨酸450
‑
460mg/L；L
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亮氨酸600
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620mg/L；L
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缬氨酸450
‑
460mg/L；L
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脯氨酸300
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310mg/L；丙酮酸钠0.3
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0.8mL/L；壳寡糖1
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4mg/L；叶酸0.05
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0.2mg/L。2.根据权利要求1所述的一种提高β
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2微球蛋白在HEK
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293细胞中表达水平的细胞转染培养方法，其特征在于：所述营养添加剂由以下浓度的组分组成：
L
‑
精氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：李长路，
申请(专利权)人：广州蕊特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：