一种白蛋白细胞转染方法技术

本申请涉及一种白蛋白细胞转染方法，属于细胞转染领域。包括以下步骤：1）细胞以及培养基准备；2）分别配置分别含有Albumin

【技术实现步骤摘要】
一种白蛋白细胞转染方法


[0001]本专利技术涉及细胞转染领域，尤其是涉及一种白蛋白细胞转染方法。

技术介绍

[0002]白蛋白（albumin，又称清蛋白）是人体血浆中最主要的蛋白质，维持机体营养与渗透压，因此在医学应用上需求量较大，一般通过天然提取或体外重组获得，由于天然蛋白提取自动物组织，而重组蛋白是通过基因工程重组而来的，因此，重组获得的白蛋白相比天然提取的白蛋白具有更高的活性与纯度，有利于人体更好地吸收利用，安全性方面也能够得到更好的保障。
[0003]基因重组过程是指通过载体（质粒）转染至工程细胞中，使其携带有目的蛋白基因片段，再利用细胞培养表达目标蛋白。目前，白蛋白细胞的转染一般通过将Albumin
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His tag/pcDNA3.1(+)质粒与阳离子聚合物转染剂复配制得质粒
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阳离子聚合物的复合成分，再将该复合成分投加于含有HEK293细胞或CHO细胞的培养基中，利用电荷的吸附作用，将质粒吸附于带有负电荷的细胞膜上，从而通过细胞的内吞作用使质粒进入细胞膜中，完成白蛋白细胞转染。
[0004]阳离子聚合物转染的效率与阳离子聚合物的分子量、支链化程度、阳离子电荷密度呈正相关，但是，阳离子聚合物会对工程细胞有一定的细胞毒性，阳离子聚合物的分子量越大、支链化程度越高、阳离子电荷密度越大，对细胞的毒害性就越高，因此，为了提高转染后细胞的存活率，使得后续的细胞培养能够具有高量的目标蛋白表达，对阳离子聚合物的选择会有一定的局限性，从而导致白蛋白的细胞转染效率不尽人意，有待进一步改进。

技术实现思路

[0005]为了解决上述技术问题，本申请提供一种白蛋白细胞转染方法，采用如下的技术方案：一种白蛋白细胞转染方法，包括以下步骤：步骤1）细胞以及培养基准备：转染当天，细胞活率≥90%，100mL培养基的细胞浓度在3
×
10
6 cells/mL左右；步骤2）配置转染工作液：分别以KPM缓冲液配置分别配置15mL的三种混合液，分别为含有100～150μg 的Albumin
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His tag/pcDNA3.1(+)基因片段质粒混合液、含有400～600μL的转染A试剂混合液以及含有400～600μL的转染B试剂混合液；步骤3）配置质粒
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PEI复合物：将步骤2）的含有转染A试剂混合液转至含有Albumin
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His tag/pcDNA3.1(+)基因片段质粒混合液中，室温静置10min，形成质粒
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PEI复合物；步骤4）质粒
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PEI复合物转染细胞：将步骤3）的制成的质粒
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PEI复合物滴加至步骤1）的培养基中悬浮培养12h，再往培养基中滴加步骤2）的含有转染B试剂混合液；所述转染A试剂包括：γ
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环糊精0.3ng/mL、鲁斯可皂苷元0.005ng/mL、羧甲基壳聚
糖0.15ng/mL、聚乙烯亚胺5ng/mL；所述转染B剂包括：丝素6ng/mL、聚赖氨酸2ng/mL、聚乙二醇二缩水甘油醚0.3ng/mL。
[0006]优选的，100mL含有HEK
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293细胞的培养基投加含有100μg 的Albumin
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His tag/pcDNA3.1(+)基因片段质粒混合液。
[0007]优选的，100mL含有HEK
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293细胞的培养基投加含有500μL的转染A试剂混合液以及含有300μL的转染B试剂混合液。
[0008]通过采用以上转染方法，首先采用含有鲁斯可皂苷元的阳离子PEI聚合物转染剂进行细胞转染，利用转染A剂中聚乙烯亚胺的阳离子与表面带负电的细胞吸附作用，使得含有Albumin
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His tag/pcDNA3.1(+)基因片段质粒吸附于细胞膜表面，同时，质粒上带有的微量鲁斯可皂苷元能够降低细胞膜通透性，促进提高细胞对质粒的内吞作用，使得转染效率明显提高，此外，通过在质粒转染效率接近平台后投加转染B剂，利用含有丝素的胞吞后的张力较低的细胞膜部位处具有的生物修复作用，使得细胞膜在转染后存活条件得到改善，从而大幅提高了转染后细胞活性，使得细胞转染效率得到进一步的提升，有利于更好地稳定转染获取表达水平更高的重组白蛋白产物。
[0009]优选的，所述培养基细胞为HEK
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293细胞。
[0010]通过以HEK
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293细胞作为重组白蛋白工程细胞，具有更理想的转染稳定性以及蛋白表达水平。
[0011]优选的，所述转染A剂的制备方法为：在20KHz的超声震荡和200RPM的搅拌条件下，往γ
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环糊精溶液中依次缓慢滴加鲁斯可皂苷元溶液、羧甲基壳聚糖溶液，滴加结束后继续搅拌6h，然后再缓慢滴加聚乙烯亚胺溶液，滴加结束后继续搅拌12h，用0.2μm滤膜过滤，与KPM缓冲液混合，得到转染A剂。
[0012]通过采用上述制备方法，利用静电作用原理，把带有负电荷的羧甲基壳聚糖簇拥鲁斯可皂苷元自组装至γ
‑
环糊精上，并通过羧甲基壳聚糖与聚乙烯亚胺的氢键结合，从而将鲁斯可皂苷元引入至聚乙烯亚胺上。
[0013]优选的，所述转染B剂的制备方法为：在20KHz的超声震荡和200RPM的搅拌条件下，往含有丝素的溶液中依次缓慢滴加聚赖氨酸溶液、聚乙二醇二缩水甘油醚溶液，滴加结束后继续搅拌10h，用0.2μm滤膜过滤，与KPM缓冲液混合，得到转染B剂。
[0014]通过采用上述制备方法，聚乙二醇二缩水甘油醚促使聚赖氨酸与丝素交联结合，利用聚赖氨酸中含有的多酚结构基元作为粘附位点，使得丝素更好地吸附于细胞膜上而起到修复作用。
[0015]优选的，溶解所述丝素的溶液以质量比为1:3:6的氯化钙、乙醇和水混合制得。
[0016]优选的，所述转染B试剂的丝素为ASF丝素。
[0017]通过将含有ASF丝素与胞吞质粒后的细胞混合，由于ASF丝素含有由特殊的天门冬氨酸
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甘氨酸
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精氨酸三肽结构，使其与HEK
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293细胞具有更好的吸附效果与修复效果。
[0018]溶解所述丝素的溶液以质量比为1: (3～4): (5～6)的氯化钙、乙醇和水混合制得。
[0019]通过将氯化钙、乙醇和水以特定配比混合，能够更好地溶解丝素，提高丝素利用率。
[0020]综上所述，本申请包括以下至少一种有益技术效果：1.通过对含有Albumin
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His tag/pcDNA3.1(+)白蛋白基因片段的质粒采用两步法转染，首先利用含有γ
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环糊精、鲁斯可皂苷元、羧甲基壳聚糖的聚乙烯亚胺阳离子质粒载体与细胞混合，通过电荷吸附作用与细胞膜通透性降低作用，有助于质粒更好地通过内吞作用进入细胞中，然后再利用含有丝素、聚赖氨酸、聚乙二醇二缩水甘油醚的混合液与细胞混合，使得胞本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种白蛋白细胞转染方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1）细胞以及培养基准备：转染当天，细胞活率≥90%，100mL培养基的细胞浓度在3
×
10
6 cells/mL左右；步骤2）配置转染工作液：分别以KPM缓冲液配置分别配置15mL的三种混合液，分别为含有100～150μg 的Albumin
‑
His tag/pcDNA3.1(+)基因片段质粒混合液、含有400～600μL的转染A试剂混合液以及含有400～600μL的转染B试剂混合液；步骤3）配置质粒
‑
PEI复合物：将步骤2）的含有转染A试剂混合液转至含有Albumin
‑
His tag/pcDNA3.1(+)基因片段质粒混合液中，室温静置10min，形成质粒
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PEI复合物；步骤4）质粒
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PEI复合物转染细胞：将步骤3）的制成的质粒
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PEI复合物滴加至步骤1）的培养基中悬浮培养12h，再往培养基中滴加步骤2）的含有转染B试剂混合液；所述转染A试剂包括：γ
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环糊精0.3ng/mL、鲁斯可皂苷元0.005ng/mL、羧甲基壳聚糖0.15ng/mL、聚乙烯亚胺5ng/mL；所述转染B剂包括：丝素6ng/mL、聚赖氨酸2ng/mL、聚乙二醇二缩水甘油醚0.3ng/mL。2.根据权利要求1所述的一种白蛋白细胞转染方法，其特征在于，所述培养基细胞为HEK
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【专利技术属性】
技术研发人员：李长路，
申请(专利权)人：广州蕊特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：