一种用于siRNA快速筛选的双荧光素酶报告系统的构建及其应用技术方案

本发明专利技术属于生物医学范畴中的基因治疗领域，特别是一种用于快速筛选出高效的siRNA的应用。萤光素酶是理想的报告基因，因为哺乳动物细胞中不含内源性萤光素酶，一旦转录完成立刻就生成功能性的萤光素酶。单报告基因实验往往会受到各种实验条件的影响，而双报告基因则通过共转染的“对照”作为内参为试验提供一基准线，从而可以在最大程度上减小细胞活性和转染效率等外在因素对实验的影响，使得数据结果更为可信。双萤光素酶报告基因检测系统在细胞中同时表达萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶，两者没有种源同源性并对应不同的反应底物，故而没有交叉干扰。得益于超强的光信号和超高的信噪比，本系统被广泛用于siRNA靶基因验证。本发明专利技术通过荧光素酶偶联靶基因序列共转录，涵盖了双质粒和单质粒的双荧光素酶载体，通过与siRNA共转染，实现快速、大规模批量化筛查siRNA的效率。siRNA的效率。siRNA的效率。

【技术实现步骤摘要】
一种用于siRNA快速筛选的双荧光素酶报告系统的构建及其应用


[0001]本专利技术属于生物医学范畴中的基因治疗领域，特别是一种用于快速筛选出高效的siRNA的应用。

技术介绍

[0002]小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）长度为21
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22 nt，是RNAi （RNA interference）中的活性因子，能导向同源mRNA并将其降解。在哺乳动物中，siRNA有望成为一种强大的工具，不仅可以用于功能基因组学所必需的大规模基因沉默，而且可以用于治疗目的，包括抗病毒治疗。
[0003]siRNA介导的RNAi包括两个不同的siRNA序列依赖步骤：RNA诱导沉默复合体（RNA
‑
induced silencing complex，RISC）的形成和靶mRNA的识别。长双链RNA（double strands RNA，dsRNA）和复杂的发夹前体被核糖核酸酶家族Ⅲ（RNase
ꢀⅢ
）的核糖核酸内切酶（Dicer）分解为siRNA 双链片段，随后双链siRNA 被拆分成随从链和引导链。在RNAi的作用过程中，引导链与Argonaute（Argo）蛋白家族中的Argo2 在细胞质内结合形成siRNA 诱导沉默复合体，随从链随后被降解。在镁离子和ATP 的参与下，RISC被激活与目标序列结合，结合的mRNA 被切割和降解,从而抑制或影响靶基因的表达进而降低蛋白的表达水平。其中，引导链可以识别靶点信息，Argo2 蛋白则是切割靶标mRNA 的剪刀，二者缺一不可。
[0004]小干扰药物作为小核酸药物研发的热点，凭借基因沉默效率高、不良反应可控、合成方便等优点，得到了广泛应用。siRNA 的结构使其具有一定的免疫原性并容易被核酸酶降解，限制了其在体内的应用。近年来,研究人员把研究重点放在了siRNA 的稳定性修饰和提高靶向效率上。一方面，在化学结构上修饰siRNA，增强了体内稳定性和生物利用度；另一方面，通过构建靶向不同器官或组织的递送系统，高效、安全地将siRNA 传递到靶组织,实现了疾病的针对性治疗。这些都是siRNA 成药的关键步骤。2018 年，美国FDA 批准用于治疗由遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性（hereditary transthyretin amyloidosis, hATTR）引起的周围神经疾病的siRNA 药物——Patisiran，填补了siRNA 药物研发领域的空白，为接下来siRNA 药物的发展开辟了先河。近年来，鉴于siRNA 药物广阔的市场和应用前景，以Alnylam 公司、Lonis 公司、Quark 公司为首的研发型公司持续增加对siRNA 药物的研发投入，其领域涉及罕见病、肿瘤、心血管疾病、慢性病、眼科疾病等。
[0005]荧光素酶是对所有能够利用对应底物产生生物荧光的酶的统称。当底物充足时，发出的荧光量与酶活性呈正比，常见的荧光素酶有萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase）、细菌荧光素酶（LuxAB）及海肾荧光素酶（Rellina Luciferase）三类。双荧光素酶报告基因检测系统（Dual
‑
Luciferase Reporter Assay）由萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶组成。两种荧光素酶无需修饰，只要正常转录即具有活性，其中海肾荧光素酶作为转染的内参，来减少孔间细胞数量和转染效率对实验结果的影响。萤火虫荧光素酶在氧气、ATP和镁离子同时存在的条件下，催化荧光素氧化，生成氧化荧光素，同时产生黄绿色光，波
长540
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600nm，一般检测时选用560nm。海肾荧光素酶只需要氧气就可以催化腔肠素氧化产生蓝光，波长460
‑
540nm，一般检测时选用460nm，通过特定的荧光检测仪检测荧光量来判断酶的活性，进而反映基因间的关系。荧光素酶作为一种理想的报告基因，可用于启动子研究、miRNA研究、信号转导通路研究等等。
[0006]一般情况下，海肾荧光素酶基因作为内对照使用，将带有海肾荧光素酶基因的质粒与报告基因质粒共转染细胞；或是将两个报告基因构建到同一个质粒上，分别用不同的启动子启动其表达。计算结果时，将萤火虫荧光素酶的检测值比上海肾荧光素酶检测值，这样就可以减少内在变化因素对实验准确性的影响，使测试结果不受实验条件变化的干扰。
[0007]siRNA 裸序列不稳定，在体内递送困，不易到达靶点发挥作用，成为早期siRNA 药物研发的阻力。近年来，siRNA 的稳定性修饰以及高效递送系统的开发，大大加快了siRNA 药物的研发进展，然而，由于针对靶基因的siRNA数量众多，常规方法通过qPCR检测效率低下，难以满足药物研发高通量的筛选，如何快速筛选出一批高效的siRNA作为候选分子进行后续实验仍需要克服。
[0008]为此，鉴于siRNA筛选的特点，可能在利用双荧光素酶报告系统进行快速筛选的潜力，本专利技术拟用了双荧光素酶，构建目标基因的单质粒和双质粒荧光素酶载体用于siRNA快速筛选。所涉及的方法为使用双荧光素酶报告系统，通过连接目标基因序列到载体上，从而实现荧光素酶与目标质粒的共转录，利用siRNA转染至细胞，随后检测荧光，与内参比值作为衡量siRNA工作效率高低的一套筛选系统。

技术实现思路

[0009]传统上，利用脂质体在相关基因表达量高的细胞系中转染siRNA，随后通过RNA提取，反转录成cDNA，使用qPCR来检测siRNA的敲降效率。这种方法过度依赖于细胞系中靶基因的表达，针对不同靶基因需要寻找相关表达量高的细胞系，且qPCR检测方法不适合高通量siRNA效率的筛选。为了解决上述技术问题，本专利技术将提供一种利用双载体或单载体质粒表达与靶基因序列偶联的荧光素酶报告系统，并使用报告质粒与siRNA共转染细胞，通过化学发光检测siRNA的敲降效率，该方法能够在使用单一的细胞系实现高通量siRNA效率的筛选。
[0010]本专利技术提供的技术方案之一，是一种靶基因序列偶联表达萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的双载体系统表达盒，所述双载体系统包括两段核苷酸序列：第一个载体的核苷酸序列的表达盒包括：包括启动子，hRluc序列和poly(A)信号/ PolyA；第二个载体的核苷酸序列的表达盒包括：包括启动子，靶基因序列5
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UTR + CDS序列，hRluc序列和SV40 poly(A)信号/PolyA；第三个载体的核苷酸序列的表达盒包括：包括启动子，Fluc序列，靶基因序列CDS + 5
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UTR序列和SV40 poly(A)信号/PolyA；所述靶基因序列，是成熟mRNA包含5
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UTR，CDS，3
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UTR序列;所述启动子包括但不限限于：CAG启动子，CMV启动子，CBA启动子，UbC启动子，SFFV启动子， EF1α启动子，PGK启动子，或Myo7A、Myo15、Atoh1、POU4F3、Lhx3、Myo6、α9AchR本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达双荧光素酶的双载体系统，其特征在于，所述双载体系统包括两个独立的荧光素酶核酸序列：第一段核酸序列：包括一个表达海肾荧光素酶表达盒作为内参；第二段核酸序列：包括一个表达萤火虫荧光素酶融合CDS + 3
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UTR序列表达盒作；一个和表达萤火虫荧光素酶融合5
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UTR + CDS序列表达盒。2.一种表达双荧光素酶的单载体系统，其特征在于，所述单一载体包括两个独立的荧光素酶表达盒：第一段核酸序列：包括一个表达萤火虫荧光素酶表达盒作为内参；第二段核酸序列：包括一个表达海肾荧光素酶融合CDS + 3
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【专利技术属性】
技术研发人员：肖浦豪，张睿，
申请(专利权)人：上海鼎新基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：