一种治疗听力损伤的双载体系统及其应用技术方案

本发明专利技术属于医疗范畴中的基因治疗领域，特别是一种利用正常基因的过表达来恢复由基因突变或缺失引发遗传性耳聋患者听力的应用

【技术实现步骤摘要】
一种治疗听力损伤的双载体系统及其应用


：
[0001]本专利技术属于医疗范畴中的基因治疗领域，特别是一种利用正常基因的过表达来恢复由基因突变或缺失引发遗传性听力损失的应用
。

技术介绍

：
[0002]耳是人体的重要器官，由外耳
、
中耳和内耳构成，其主要功能是感知声音和维持身体平衡
。
当耳功能异常时会导致一系列身体机能的病变，包括耳聋，耳鸣，眩晕等
。
[0003]耳聋是一种听觉功能异常的常见疾病，可分为先天性耳聋和后天性耳聋，多与遗传因素和环境因素相关
。
每
1000
个新生婴儿中就有2位先天性耳聋，其中
50
‑
60
％患者的耳聋均由基因突变引起；基因突变导致的耳聋可分为显性基因突变和隐性基因突变
。
其中，显性耳聋基因包括
ACTG1
，
CCDC50
，
CD164
，
CEACAM16
，
DIAPH1
等，隐性耳聋基因包括
CLDN14
，
PJVK
，
GRXCR1
，
MYO7A
，
MYO6
，
MYO3A
，
MYO15A
，
OTOF
，
OTOG
，
OTOA
，
STRC
，
>TMC1
，
SLC22A4
，
SLC26A4
，
SLC26A5
，
TECTA
，
GJB2
和
GJB6
等
。
这些耳聋基因的发现为遗传性耳聋的精准治疗提供潜在的靶点，因此当上述基因引发耳聋时，基因治疗可以作为耳聋根治的首选策略
。
[0004]基因治疗是指通过在
DNA
或
RNA
层面进行纠正
、
补偿或抑制，从而使体内核酸序列或表达异常所引起的疾病恢复，达到治疗目的的方法
。
目前大部分基因治疗都需要载体递送，腺相关病毒
(Adeno
‑
AsociatedVirus
，
AAV)
是其中一种安全
、
高效的递送载体，它的包装容量约为
4.7Kb。
然而，在耳聋领域，许多基因编码区长度并不适合腺相关病毒的包装，如
BDP1
，
CDH23
，
COL11A2
，
LOXHD1
，
MET
，
MYO15A
，
MYO3A
，
MYO7A
，
OTOG
，
OTOF
，
OTOGL
，
PCDH15
，
PTPRQ
，
STRC
，
TECTA
，
TARA
等，它们的编码区长度均超过
4kb
，连同相关调控元件会超过
AAV
载体的包装限制
。
尽管目前采用
DNA
重组双载体解决了该问题，但
DNA
重组双载体包装在体内重组效率较低
。
[0005]在编码序列长度大于
4kb
的耳聋相关基因中，
OTOF
在听力中发挥了重要作用
。OTOF
蛋白主要表达在耳蜗的内耳毛细胞中，主要作用是结合钙离子
(Ca
2+
)
，并启动下游神经递质的释放
。OTOF
基因的缺失或功能丧失性突变会引起
DFNB9
耳聋
。
[0006]OTOF
基因
(NCBI Gene ID
：
9381)
转录后拥有不同的转录本，包括
isoform 1(NM_194248.3)
，
isoform 2(NM_004802.4)
，
isoform 3(NM_194322.3)
，
isoform 4(NM_194323.3)
和
isoform 5(NM_001287489.2)。
它们均来源于同一
RNA
的不同剪切，其中与内耳毛细胞听力相关的剪切体为
isoform 1
或
isoform 5。
这两个转录本
CDS
区长度均为
5994bp
，编码了一个长度为
1997
个氨基酸的蛋白
。
[0007]对于
OTOF
基因突变引起的先天性耳聋来说，尽管
AAV
具有递送不整合，表达时间长，免疫原性低等特点，是首选的运载工具，但
AAV
包装容量小于
4.7kb
，存在包装限制问题，无法满足
OTOF
基因的包装
(OTOF
基因加上调控序列全长超过
7kb)。
为了解决
OTOF
的包装问题，目前主要有三种方法
。
其一为过载包装，主要利用此法将长度为
7.5kb
的基因表达元件包装到一个
AAV
病毒，并注射到小鼠耳蜗，其作用一段时间后能够观察到约
30
％的内耳毛细胞表达
OTOF
蛋白，将小鼠听力恢复到
58dB
左右
。
但过载包装存在包装效率低，产品不易控制
和转染效率低的问题，并不是最佳的解决方案
。
其二是缩短功能型
OTOF
所需要的编码序列长度，
OTOF
是一个
C2
结构域蛋白，由
A、B、C、D、E、F 6
个
C2
结构域和一个
TEM
域组成，研究发现由其中几个结构域组成的迷你
OTOF
能够部分恢复
OTOF
的功能，但是并不能恢复动物听力
。
其三是用双载体的方法进行
DNA
重组，产生全长成熟的
OTOF mRNA
并完成蛋白的翻译
。
具体又可以分为重叠
(overlapping)
，反式剪接重组
(trans
‑
splicing)
或重叠和反式剪接的结合方式
。
[0008]尽管
DNA
重组策略可本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种表达
OTOF
蛋白的双载体系统，其特征在于，所述双载体系统包括两段核苷酸序列：第一段核苷酸序列：包括两个
ITR
序列和插入
ITR
序列之间的表达盒；第二段核苷酸序列：包括两个
ITR
序列和插入
ITR
序列之间的表达盒；第一段核苷酸序列的表达盒包括：启动子
、OTOF N
端编码序列
、Intein
的
N
端编码序列和
PolyA
；第二段核苷酸序列的表达盒包括：启动子
、Intein
的
C
端编码序列
、OTOF C
端编码序列和
PolyA
；在
OTOF
氨基酸序列上设置分割点，自
OTOF
氨基酸序列的
N
端至分割点的核苷酸编码序列即为
OTOF N
端编码序列，自分割点下一位氨基酸至
OTOF
氨基酸序列的
C
端的核苷酸编码序列即为
OTOF C
端编码序列
。2.
如权利要求1所述的一种表达
OTOF
蛋白的双载体系统，其特征在于，
OTOF
的氨基酸序列，如序列表
SEQ ID NO.1
或
SEQ ID NO.2
所示
。3.
如权利要求1所述的一种表达
OTOF
蛋白的双载体系统，其特征在于，
OTOF
的分割位点包括但不限于
OTOF
蛋白氨基酸序列中丝氨酸，苏氨酸或半胱氨酸的前一位氨基酸
。4.
如权利要求1所述的一种表达
OTOF
蛋白的双载体系统，其特征在于，所述启动子包括但不限限于：
CAG
启动子，
CMV
启动子，
CBA
启动子，
UbC
启动子，
SFFV
启动子，
EF1
α
启动子，
PGK
启动子，或
Myo7A、Myo15、Atoh1、POU4F3、Lhx3、Myo6、
α
9AchR、
α
10AchR、OTOF
等编码基因的启动子；所述
PolyA
，包含
AATAAA
及其变体，包括但不限于
ATTAAA,AGTAAA,CATAAA,TATAAA,GATAAA,ACTAAA,AATATA,AAGAAA,AATAAT,AAAAAA,AATGAA,AATCAA,AACAAA,AATCAA,AATAAC,AATAGA,AATTAA
或
AATAAG
；所述
ITR
序列来自于
AAV1
，
AAV2
，
AAV3
，
AAV4
，
AAV5
，
AAV6
，
AAV7
，
AAV8
或
AAV9。5.
如权利要求1所述的一种表达
OTOF
蛋白的双载体系统，其特征在于，所述表达盒还包括表达调控元件或标签元件
。6.
如权利要求1所述的一种表达
OTOF
蛋白的双载体系统，其特征在于，所述
Intein
选自
MxeGyrA
，
pabPolIII
，
MjaKlbA
，
SspDnaB
，
SceVMA
，
SspDnaE
，
NpuDnaE
，
AvaDnaE
，
CraDnaE
，
CspDnaE
，
CwaDnaE
，
MchtDnaE
，
OliDnaE
，
TerDnaE
，
gp41
‑1，
gp41
‑8，
IMPDH
‑1，或
RmaDnaB
的
Intein
序列
。7.
如权利要求1所述的一种表达
OTOF
蛋白的双载体系统，其特征在于，第一段核苷酸序列是在包含
ITR
的质粒上并在
ITR
序列间插入上述第一段核苷酸序列的表达盒；第二段核苷酸序列是在包含
ITR
的质粒上并在
ITR
序列间插入上述第二段核苷酸序列的表达盒
。8.
如权利要求7所述的一种表达
OTOF
蛋白的双载体系统，其特征在于，所述包含
ITR
的质粒为
pAAV
，
pAAV
‑
CMV、pX601
，
pX551
或
pAAV
‑
MCS
质粒
。9.
如权利要求1所述的一种表达
OTOF
蛋白的双载体系统，其特征在于，将
SEQ ID NO.2
所示的
OTOF
，以第
827
位氨基酸为分割点，并采用
NpuDnaE Intein
；将
OTOF
的
N
端编码序列与
NpuDnaE Intein
的
N
端编码序列进行连接融合后，以
pAAV
‑
CMV
质粒为载体构建第一段核苷酸序列；将
NpuDnaE Intein
的
C
端编码序列与
OTOF
的
C
端编码序列进行连接融合后，以
pAAV
‑
CMV
质粒为载体构建第二段核苷酸序列；或者
将
SEQ ID NO.2
所示的
OTOF
，以第
930
位氨基酸为分割点，并采用
NpuDnaE Intein
；将
OTOF
的
N
端编码序列与
NpuDnaE Intein
的
N
端编码序列进行连接融合后，以
pAAV
‑
CMV
质粒为载体构建第一段核苷酸序列；将
NpuDnaE Intein
的
C
端编码序列与
OTOF
的
C
端编码序列进行连接融合后，以
pAAV
‑
CMV
质粒为载体构建第二段核苷酸序列；或者将<...

【专利技术属性】
技术研发人员：舒易来，李华伟，周睿，谭青乔，汤洪海，王会，高凯瑜，
申请(专利权)人：上海鼎新基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：