用于治疗包括肢带型2I（LGMD2I）的抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱的fukutin相关蛋白（FKRP）的治疗性腺相关病毒递送制造技术

本文公开了编码fukutin相关蛋白(FKRP)的各种优化的核酸。还公开了用于(例如在骨骼肌和心肌中)表达蛋白质的包含所述优化的核酸(例如与肌肉特异性启动子可操作地连接)的重组载体(例如重组腺相关病毒载体)，以及含有所述载体的治疗组合物。还公开了给予受试者所述载体以治疗患有抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱(例如肢带型肌营养不良2I)的受试者的治疗方法。肢带型肌营养不良2I)的受试者的治疗方法。肢带型肌营养不良2I)的受试者的治疗方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗包括肢带型2I(LGMD2I)的抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱的fukutin相关蛋白(FKRP)的治疗性腺相关病毒递送
相关申请的交叉引用
[0001]根据35U.S.C.
§
119(e)，本申请要求2020年10月7日提交的美国临时申请No.63/088,757、2021年6月23日提交的美国临时申请No.63/214,123以及2021年8月5日提交的美国临时申请No.63/229,726的权益，通过引用将其中每个的内容以其整体并入本文。


[0002]本专利技术涉及基因疗法和抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱(dystroglycanopathy disorders)的治疗的领域。

技术介绍

[0003]肢带型肌营养不良(Limb girdle muscular dystrophy)或LGMD代表了二十多种罕见的一大类遗传性肌病，与连接肩部或髋部的肌肉(通常被称为肢带)的无力和萎缩有关。根据遗传性肌病分别作为显性疾病遗传还是作为隐性疾病遗传，将其细分为LGMD1组和LGMD2组。每一种LGMD都是由不同基因的突变引起的。
[0004]与LGMD2I相关的症状通常在儿童晚期出现，彼时受困扰的儿童开始出现跑步和行走困难。随着时间的推移，症状和行动问题逐渐恶化，患者通常在发病后23到26年之间依赖轮椅。肩部和手臂无力会给握持、搬运和举起物体带来挑战，并可导致需要辅助设备。该疾病还可导致呼吸困难、心肌疾病和心律失常，以及收缩诱导的对肌纤膜的剪切损伤，这是导致LGMD2I表型的主要病变。抗肌萎缩蛋白聚糖是dystrophin
‑
糖蛋白复合物(或DGC)的中心蛋白，其糖基化对于将肌肉细胞的结构元件灵活连接到其周围的结构(称为细胞外基质(或ECM)至关重要。FKRP将核糖醇
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P附接到逐步修饰α
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DG的聚糖序列上。一项使用高效液相色谱(或HPLC)、质谱和核磁共振(或NMR)相结合的权威研究表明，fukutin相关蛋白(FKRP)是一种转移酶，它将两种核糖醇
‑5‑
磷酸中的第二个插入聚糖链的配体结合部分紧前的聚糖链中。该聚糖链的任何部分的缺失导致α
‑
DG无法与其ECM靶标结合，从而导致肌纤膜或细胞膜上的反复应力，这是许多LGMD(包括LGMD2I)的标志。根据对公开可用的基因组数据库的分析，估计每百万人中有4.3人患有LGMD2I。LGMD2I在北欧最为普遍，这是由于群体建立者突变效应，其中，在为地理或文化上隔离的群体或曾为地理或文化上隔离的群体中，编码FKRP的基因发生了高频率的基因改变，并且一个或多个祖先是经改变的基因的携带者。
[0005]编码FKRP的基因突变导致广泛的疾病表型，包括轻度肢带型肌营养不良2I(LGMD2I)、严重Walker
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Warburg综合征和肌眼脑疾病。目前，尚不清楚涉及α
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DG糖基化减少的抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱的有效疗法(Xu等，Mol.therapy 21:10doi:10.1038/mt.2013.156(2013年7月2日))。目前还没有批准的用于LGMD2I的疗法，治疗旨在症状管理，包括支持性护理和移动辅助设备。

技术实现思路

[0006]本专利技术的各方面涉及重组腺病毒相关(AAV)载体，该载体在其基因组中以5'至3'的方向包含a)5'AAV反向末端重复(ITR)；b)肌肉特异性启动子；c)内含子序列；d)编码人fukutin相关蛋白(FKRP)的核酸，所述核酸具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，并与所述肌肉特异性启动子可操作地连接；e)polyA信号序列，所述polyA信号序列与所述编码FKRP的核酸可操作地连接；f)3'AAV ITR。
[0007]在本文所述的rAAV载体和方法的一些实施方式中，5'ITR为ITR2m。
[0008]在本文所述的rAAV载体和方法的一些实施方式中，3'ITR为ITR2。
[0009]在本文所述的rAAV载体和方法的一些实施方式中，肌肉特异性启动子为Syn100(SEQ ID NO：3)。
[0010]在本文所述的rAAV载体和方法的一些实施方式中，内含子序列为VH4
‑
Ig内含子3(SEQ ID NO：4)或其衍生物。
[0011]在本文所述的rAAV载体和方法的一些实施方式中，polyA信号序列为SEQ ID NO：5。
[0012]在本文所述的rAAV载体和方法的一些实施方式中，肌肉特异性启动子、内含子序列、编码FKRP的核酸和polyA信号序列包含在SEQ ID NO：1中。
[0013]在本文所述的rAAV载体和方法的一些实施方式中，血清型为AAV9。
[0014]本专利技术的各方面还涉及包含上述所述和本文所述的重组AAV载体的各种实施方式的药物组合物。
[0015]本专利技术的各方面还涉及治疗患有抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱的受试者的方法，所述方法包括向受试者系统性给予治疗有效量的本文所述的重组AAV载体和/或本文所述的药物组合物的各种实施方式，从而增加受试者的肌肉组织中的功能性FKRP的表达。
[0016]在本文所述方法的一些实施方式中，抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱为肢带型肌营养不良2I。
[0017]在本文所述方法的一些实施方式中，给予受试者单剂量。
[0018]在本文所述方法的一些实施方式中，通过静脉输注给予。
[0019]在本文所述方法的一些实施方式中，给予剂量为约1E13vg/kg至约6E13 vg/kg(例如约3E13 vg/kg)。
[0020]在本文所述方法的一些实施方式中，给予后受试者发生以下中的一种或多种：a)受试者的骨骼肌和/或心肌中α
‑
DG的功能性糖基化显著增加；b)受试者的血清肌酸激酶水平显著降低；c)受试者的骨骼肌中的胶原沉积显著降低；d)受试者的肌肉组织(例如比目鱼肌、膈膜和/或EDL)的体外肌力分析显著增加；e)受试者的潮气量显著增加；和/或f)受试者可在平板运动试验中显著地跑得更远。
[0021]在本文所述方法的一些实施方式中，受试者为成年受试者、青少年受试者或婴儿受试者。在本文所述方法的一些实施方式中，受试者为雄性/男性或雌性/女性。
[0022]本专利技术的各方面还涉及编码人fukutin相关蛋白(FKRP)的合成核酸，其中：a)相对于SEQ ID NO：6的CpG位点含量，所述核酸的CpG位点含量降低；b)相对于SEQ ID NO：6的GC含量，GC含量降低了大于10％；和/或c)所述核酸与SEQ ID NO：2具有至少80％的同一性。
[0023]在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，相对于SEQ ID NO：6的
CpG位点含量，所述编码序列的CpG位点含量降低至少50％。
[0024]在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，相对于SEQ ID本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种重组腺病毒相关(AAV)载体，所述载体在其基因组中以5'至3'方向包含：a)5'AAV反向末端重复(ITR)；b)肌肉特异性启动子；c)内含子序列；d)编码人fukutin
‑
相关蛋白(FKRP)的核酸，所述核酸具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：407中所示的核苷酸序列，并与所述肌肉特异性启动子可操作地连接；e)与所述编码FKRP的核酸可操作地连接的polyA信号序列；f)3'AAV ITR。2.如权利要求1所述的重组AAV载体，其中，所述5'ITR为ITR2m。3.如权利要求1
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2中任一项所述的重组AAV载体，其中，所述3'ITR为ITR2。4.如权利要求1
‑
3中任一项所述的重组AAV载体，其中，所述肌肉特异性启动子为Syn100(SEQ ID NO：3)。5.如权利要求1
‑
4中任一项所述的重组AAV载体，其中，所述内含子序列为VH4
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Ig内含子3(SEQ ID NO：4)或其衍生物。6.如权利要求1
‑
5中任一项所述的重组AAV载体，其中，所述polyA信号序列为SEQ ID NO：5。7.如权利要求1
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6中任一项所述的重组AAV载体，其中，所述肌肉特异性启动子、内含子序列、编码FKRP的核酸以及polyA信号序列包含在SEQ ID NO：1内。8.如权利要求1
‑
7中任一项所述的重组AAV载体，其中，血清型为AAV9。9.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1
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8中任一项所述的重组AAV载体。10.一种治疗患有抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者系统性给予治疗有效量的如权利要求1
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8中任一项所述的重组AAV载体和/或如权利要求9所述的药物组合物，从而增加所述受试者的肌肉组织中功能性FKRP的表达。11.如权利要求10所述的方法，其中，所述抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱为肢带型肌营养不良2I。12.如权利要求10
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11所述的方法，其中，给予所述受试者单剂量。13.如权利要求10
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12所述的方法，其中，通过静脉输注进行g给予。14.如权利要求10
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13中任一项所述的方法，其中，所述给予剂量为约1E13 vg/kg至约6E13 vg/kg(例如约3E13 vg/kg)。15.如权利要求10
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14所述的方法，其中，以下中的一种或多种在给予后在所述受试者中发生：a)所述受试者的骨骼肌和/或心肌中α
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DG的功能性糖基化显著增加；b)所述受试者的血清肌酸激酶水平显著降低；c)所述受试者的骨骼肌中的胶原沉积显著降低；d)所述受试者的肌肉组织(例如比目鱼肌、膈膜和/或EDL)的体外肌力分析显著增加；e)所述受试者的潮气量显著增加；和/或f)所述受试者能够在平板运动试验中显著跑得更远。16.如权利要求10
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15所述的方法，其中，所述受试者为成年受试者。
17.一种编码人fukutin相关蛋白(FKRP)的合成核酸，其中：a)相对于SEQ ID NO：6的CpG位点含量，所述核酸的CpG位点含量降低；b)相对于SEQ ID NO：6的GC含量，GC含量降低了大于10％；和/或c)所述核酸与SEQ ID NO：2具有至少80％的同一性。18.如权利要求17所述的核酸，其中，相对于SEQ ID NO：6的CpG位点含量，所述编码序列的CpG位点含量降低至少50％。19.如权利要求17
‑
18所述的核酸，其中，相对于SEQ ID NO：6的CpG位点含量，所述编码序列的CpG位点含量降低至少75％、80％、85％、90％、95％。20.如权利要求17
‑
19所述的核酸，其中，所述编码序列的CpG位点含量为0％。21.如权利要求17所述的合成核酸，其中，相对于SEQ ID NO：6的GC含量，GC含量降低大于15％。22.如权利要求17所述的合成核酸，其中，所述核酸与SEQ ID NO：2具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。23.如权利要求17所述的合成核酸，其中，所述核酸具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：407中所示的序列。24.如权利要求17
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23所述的合成核酸，所述合成核酸与启动子可操作地连接。25.如权利要求24所述的合成核酸，其中，所述启动子为肌肉特异性启动子。26.如权利要求24
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25中任一项所述的合成核酸，其中，所述启动子为合成启动子。27.如权利要求24
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26中任一项所述的合成核酸，其中，所述启动子为Syn100。28.如权利要求23
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26中任一项所述的合成核酸，其中，所述启动子选自表1
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表4或表8
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表12所列的启动子。29.如权利要求24
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25中任一项所述的合成核酸，其中，所述启动子为肌酸激酶(CK)启动子、鸡β
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肌动蛋白启动子(CB)。30.如权利要求17
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29中任一项所述的合成核酸，所述合成核酸进一步包含增强子序列。31.如权利要求30所述的合成核酸，其中，所述增强子序列包含CMV增强子、肌肉肌酸激酶增强子和/或肌球蛋白轻链增强子。32.一种核酸，所述核酸包含：a)5'和3'AAV反向末端重复(ITR)；b)编码人fukutin相关蛋白(FKRP)的编码序列，所述编码序列可操作地连接至位于5'ITR和3'ITR之间的肌肉特异性启动子，其中：i)相对于SEQ ID NO：6的CpG位点含量，所述编码序列的CpG位点含量降低；ii)相对于SEQ ID NO：6的GC含量，所述编码序列的GC含量降低大于10％；和/或iii)所述编码序列与SEQ ID NO：2具有至少80％的同一性。33.如权利要求32所述的核酸，所述核酸进一步包含位于所述肌肉特异性启动子与所述编码序列之间的内含子序列。34.如权利要求33所述的核酸，其中，所述内含子序列为VH4
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Ig内含子3(SEQ ID NO：4)或其衍生物。
35.如权利要求32
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34所述的核酸，所述核酸进一步包含位于所述编码序列下游的至少一个polyA信号序列。36.如权利要求35所述的核酸，其中，所述polyA信号序列为SEQ ID NO：5。37.如权利要求32
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36所述的核酸，其中，所述5'ITR为ITR2m。38.如权利要求32
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37所述的核酸，其中，所述3'ITR为ITR2。39.如权利要求32
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38所述的核酸，其中，相对于SEQ ID NO：6的GC含量，所述编码序列的GC含量降低大于15％。40.如权利要求32
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40所述的核酸，其中，所述编码序列与SEQ ID NO：2具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。41.如权利要求32
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40所述的核酸，其中，相对于SEQ ID NO：6的CpG位点含量，所述编码序列的CpG位点含量降低至少50％。42.如权利要求32
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41所述的核酸，其中，相对于SEQ ID NO：6的CpG位点含量，所述编码序列的CpG位点含量降低至少75％、80％、85％、90％、95％。43.如权利要求32
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42所述的核酸，其中，所述编码序列的CpG位点含量为0％。44.如权利要求32
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43所述的核酸序列，其中，所述编码序列为SEQ ID NO：2。45.一种载体，所述载体包含如权利要求17
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44中任一项所述的合成核酸。46.如权利要求45所述的载体，其中，所述载体为病毒载体。47.如权利要求46所述的载体，其中，所述载体为重组腺相关病毒(AAV)载体。48.如权利要求47所述的载体，其中，所述AAV载体来自表6中列出的任何血清型。49.如权利要求47或权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：马丁，
申请(专利权)人：北卡罗来纳大学教堂山分校，
类型：发明
国别省市：