用于减少嵌合抗原受体强直信号传导的方法和组合物技术

本公开涉及与嵌合抗原受体(“CAR”)有关的方法和组合物，以及对框架序列的修饰以消除强直信号传导。所述组合物包含对硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)具有结合特异性的经修饰结合成员，并且在制备成单链抗体(scFv)并纳入CAR时是稳定的。所述方法进一步包含用于CSPG4CAR表达的核酸构建体，以及CSPG4CAR用于治疗癌症的治疗方法的应用。本公开还涉及人源化框架序列的修饰。的修饰。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于减少嵌合抗原受体强直信号传导的方法和组合物
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请根据35 U.S.C.
§
119要求于2020年6月29日提交的美国临时申请第63/045,646号的利益，该申请通过引用整体并入本文，包含其相应的序列表。
[0003]关于联邦资助的研究或开发的声明
[0004]这项工作得到了美国国立卫生研究院、Passan基金会(NVD)、美国国防部W81XWH
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16
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0500(SF)和Il Fondo di Gio Onlus(SP)的R01 CA193140(GD)、1R35 GM134864(NVD)、UL1 TR002014(NVD)、RO1DE028172(SF)、RO3CA239193(SF)和RO3CA216114(SF)的支持。GD还得到了Cell Medica的支持。内容完全由作者负责，并且不必然代表NIH的官方观点。763.74单克隆抗体及其人源化形式的序列已作为临时专利提交。
[0005]序列表的并入
[0006]序列表特此通过引用整体并入，包含名为P35071WO00_ST25.txt的文件，该文件大小为249,328字节并且创建于2021年6月27日，同样通过引用整体并入本文。

技术介绍

[0007]嵌合抗原受体(CAR)在其最初的概念中是融合蛋白，其中单克隆抗体的重链(V
H
)可变区和轻链(V
L
)可变区与不可裂解的柔性接头组装以形成单链抗体(scFv)，所述单链抗体与T细胞受体的信号传导分子和共刺激胞内域融合。参见Eshhar等人，“通过由抗体结合结构域和免疫球蛋白和T细胞受体的γ或ζ亚基组成的嵌合单链特异性激活和靶向细胞毒淋巴细胞”，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A)》90:720
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724(1993)；Finney等人，“在单一基因产物的T细胞中提供初级和共刺激信号传导的嵌合受体”，《免疫学杂志(J.Immunol.)》161:2791
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2797(1998)；Imai等人，“具有4
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1BB信号传导能力的嵌合受体引发对急性淋巴细胞白血病的强大细胞毒性”，《白血病(Leukemia)》18:676
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684(2004)。当将CD19特异性CAR移植到T细胞中，并将这些细胞输注到患有急性B细胞白血病的儿科患者中时，获得了明显和持续的抗肿瘤活性。参见Maude等人，“用于白血病的持续缓解的嵌合抗原受体T细胞”，《新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)》371:1507
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1517(2014)。
[0008]CAR与肿瘤细胞表达的抗原的接合促进了T细胞的快速和深度激活，其特点是细胞溶解、细胞因子的分泌和增殖。参见Dotti等人，“使用表达嵌合抗原受体的T细胞进行治疗的设计和开发”，《免疫学综述(Immunol.Rev.)》257:107
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126(2014)。然而，事实表明CAR可以引起T细胞的强直信号传导，这表示持续的抗原独立激活会导致T细胞迅速耗竭和抗肿瘤活性受损(Long等人，“4
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1BB共刺激改善了嵌合抗原受体的强直信号传导引起的T细胞耗竭”，《自然医学(Nat.Med.)》21:581
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590(2015)(“Long等人(2015)”)。第一篇描述CAR
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T细胞强直信号传导的报告将这种效应归因于某些scFv的自我聚集倾向，该倾向导致细胞表面的CAR成簇和随之而来的信号传导。参见同上。在其他免疫细胞(包含NKT细胞)中也观察到类似的强直信号传导。参见Xu等人，“共表达GD2特异性嵌合抗原受体和IL
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15的NKT细胞显示出体内持久性和对神经母细胞瘤的抗肿瘤活性增强”，《临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)》25(23):7126
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7138(2019)。
[0009]众所周知，V
H
和V
L
结构域偶联形成的scFv有展开的趋势，导致scFv寡聚。参见Worn和Pluckthun，“抗体单链Fv片段的稳定性工程”，《分子生物学杂志(J Mol.Biol.)》305:989
‑
1010(2001)(“Worn和Pluckthun(2001)”)。为了努力稳定scFv，已经开发了多种策略，包含在V
H
和V
L
结构域之间工程化二硫键，在V
H
和V
L
结构域内引入带电氨基酸，或将互补决定区(CDR)植入到不同的框架区(FWR)。参见Young等人，“通过引入二硫键实现单链Fv抗体片段的热稳定”，《欧洲生化学会联合会快报(FEBS Lett.)》377:135
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139(1995)；Miller等人，“用于开发双特异性和多价抗体的scFv的稳定性工程”，《蛋白质工程设计与选择(Protein Eng Des Sel)》23:549
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557(2010)；和Kugler等人，“通过设计的点突变和将CDR移植到人的框架上来稳定和人源化人类淋巴细胞抗原CD19特异性的单链Fv抗体片段”，《蛋白质工程设计与选择》22:135
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147(2009)。在组装成CAR形式的scFv的背景下，由小鼠14g2a单克隆抗体衍生的scFv引起的强直信号传导被特别归因于该抗体的FWR。参见Long等人(2015)。值得注意的是，将衍生自FMC63单克隆抗体(mAb)的scFv的CDR移植到14g2a抗体的FWR中足以引起FMC63 scFv的强直信号传导，当将这种scFv用于生成CAR时，表明FWR在引起CAR形式的scFv的强直信号传导方面起着关键作用。参见同上。
[0010]TCR介导的强直信号传导是初始T细胞的特征明确的稳态特性，并且在促进其长期持久性方面起着关键作用。参见Myers等人，“强直信号：淋巴细胞为什么烦恼？”《免疫学趋势(Trends Immunol.)》38:844
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857(2017)。然而，TCR介导的强直信号传导需要TCR与以I类或II类呈现的自体肽的接合，并且严格限制在位于淋巴器官的T细胞。参见Hochweller等人，“树突状细胞控制对外来抗原反应性所需的T细胞强直信号传导”，《美国国家科学院院刊》107:5931
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5936(2010)。与此形成鲜明对比的是，T细胞中CAR介导的强直信号传导，从严格意义上讲，是指独立于任何特定CAR接合并且定义为细胞因子如IFNγ的自发释放的CAR信号传导。参见Long等人(2015)。触发CAR介导的强直信号传导的事件已被确定为足够数量的CAR分子的自发聚集，这会导致信号传导的启动。参见Long等人(2015)。在这里，我们证实了强本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种对硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)具有结合特异性的结合成员，所述结合成员包括可变轻链序列，所述可变轻链序列包括SEQ ID NO:1
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3所示的轻链互补决定区(“LCDR”)LCDR1至LCDR3序列，以及选自由SEQ ID NO:153至221组成的群组的轻链框架序列1(VL
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FR1)；选自由SEQ ID NO:222至225组成的群组的轻链框架序列2(VL
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FR2)；选自由SEQ ID NO:226至249组成的群组的轻链框架序列3(VL
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FR3)；和选自由SEQ ID NO:250至255组成的群组的轻链框架序列4(VL
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FR4)；可变重链序列，所述可变重链序列包括SEQ ID NO:4至6所示的重链互补决定区(“HCDR”)HCDR1至HCDR3序列，以及选自由SEQ ID NO:256至349组成的群组的重链框架序列1(VH
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FR1)；选自由SEQ ID NO:350至353组成的群组的重链框架序列2(VH
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FR2)；选自由SEQ ID NO:354至360组成的群组的重链框架序列3(VH
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FR3)；和选自由SEQ ID NO:361至382组成的群组的重链框架序列4(VH
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FR4)。2.根据权利要求1所述的对CSPG4具有结合特异性的结合成员，其中所述轻链框架序列1(VL
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FR1)选自由SEQ ID NO:153至158组成的群组；所述轻链框架序列2(VL
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FR2)选自由SEQ ID NO:222至225组成的群组；所述轻链框架序列3(VL
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FR3)选自由SEQ ID NO:226至231组成的群组；并且所述轻链框架序列4(VL
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FR4)选自由SEQ ID NO:250至255组成的群组；所述重链框架序列1(VH
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FR1)选自由SEQ ID NO:347至349组成的群组；所述重链框架序列2(VH
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FR2)选自由SEQ ID NO:350至353组成的群组；所述重链框架序列3(VH
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FR3)选自由SEQ ID NO:354至360组成的群组；并且所述重链框架序列4(VH
‑
FR4)选自由SEQ ID NO:361至362组成的群组。3.根据权利要求1所述的对CSPG4具有结合特异性的结合成员，其中所述可变轻链序列包括选自由SEQ ID NO:67至109组成的群组的序列，并且所述可变重链序列包括选自由SEQ ID NO:110至152组成的群组的序列。4.一种编码多肽的核酸，所述核酸包括可变轻链序列，所述可变轻链序列包括SEQ ID NO:1
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3所示的轻链互补决定区(“LCDR”)LCDR1至LCDR3序列，以及选自由SEQ ID NO:153至221组成的群组的轻链框架序列1(VL
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FR1)；选自由SEQ ID NO:222至225组成的群组的轻链框架序列2(VL
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FR2)；选自由SEQ ID NO:226至249组成的群组的轻链框架序列3(VL
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FR3)；和选自由SEQ ID NO:250至255组成的群组的轻链框架序列4(VL
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FR4)。5.一种编码多肽的核酸，所述核酸包括可变重链序列，所述可变重链序列包括SEQ ID NO:4至6所示的重链互补决定区(“HCDR”)HCDR1至HCDR3序列，以及选自由SEQ ID NO:256至349组成的群组的重链框架序列1(VH
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FR1)；选自由SEQ ID NO:350至353组成的群组的重链框架序列2(VH
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FR2)；选自由SEQ ID NO:354至360组成的群组的重链框架序列3(VH
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FR3)；和
选自由SEQ ID NO:361至382组成的群组的重链框架序列4(VH
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FR4)。6.一种嵌合抗原受体(CAR)表达构建体，所述构建体包括编码嵌合抗原受体(CAR)编码序列的核酸序列，所述CAR编码序列包括胞外域序列，所述胞外域序列包括与硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括可变轻链序列，所述可变轻链序列包括SEQ ID NO:1
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3所示的轻链互补决定区(“LCDR”)LCDR1至LCDR3序列，选自由SEQ ID NO:153至221组成的群组的轻链框架序列1(VL
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FR1)；选自由SEQ ID NO:222至225组成的群组的轻链框架序列2(VL
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FR2)；选自由SEQ ID NO:226至249组成的群组的轻链框架序列3(VL
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FR3...

【专利技术属性】
技术研发人员：G，
申请(专利权)人：北卡罗来纳大学教堂山分校，
类型：发明
国别省市：