靶向间皮素的纳米抗体、嵌合抗原受体及其应用制造技术

本申请提供了一种靶向间皮素的纳米抗体，其包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。该纳米抗体的结构稳定性高，与间皮素的结合活性较高，对人的免疫原性较弱，可应用到过表达间皮素的阳性肿瘤的诊断、治疗中。本申请还提供了靶向间皮素的嵌合抗原受体、嵌合抗原受体T细胞及其制备、重组载体，以及它们在制备诊断和/或治疗恶性肿瘤的药物中的应用。或治疗恶性肿瘤的药物中的应用。或治疗恶性肿瘤的药物中的应用。

【技术实现步骤摘要】
靶向间皮素的纳米抗体、嵌合抗原受体及其应用


[0001]本申请涉及生物医药领域，具体涉及一种靶向间皮素的纳米抗体、嵌合抗原受体及其应用。

技术介绍

[0002]间皮素(Mesothelin，meso)是一种细胞表面糖蛋白，在正常组织中很少表达，但是在间皮瘤、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌等肿瘤中均有高表达，因此间皮素有可能成为癌症治疗的重要靶点。
[0003]目前针对间皮素为靶点的抗癌药物多是以抗体类药物为主，少数有报道CAR
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T(嵌合抗原受体T细胞)疗法。然而，靶向meso的抗体类药物的临床治疗效果有限，靶向meso的CAR
‑
T所用的单链抗体(即，scFv)基本上都是含有重链可变区和轻链可变区的小鼠来源抗体，对嵌合抗原受体的表达和稳定不利，同时在体内易引起免疫原性，治疗效果不佳。

技术实现思路

[0004]为解决上述技术问题，本申请提供了一种含靶向间皮素的纳米抗体的嵌合抗原受体及CAR
‑
T细胞，该纳米抗体作为间皮素识别点，其不含轻链可变区，易在CAR
‑
T细胞表面稳定表达，且使CAR
‑
T细胞具有较小的免疫原性，提高治疗效果和安全性。
[0005]具体地，第一方面，本申请提供了一种靶向间皮素的纳米抗体，所述靶向间皮素的纳米抗体包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
[0006]可选地，所述靶向间皮素的纳米抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。该纳米抗体的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编码基因也可以包括与SEQ ID NO:2具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:1。
[0007]本申请第一方面提供的靶向间皮素的纳米抗体(简称为VHH)较小，该纳米抗体不含轻链可变区，不会像人工改造的单链抗体片段那样容易相互粘连甚至聚集成块，因此，其结构稳定性高，且其与间皮素的结合活性较高，对人的免疫原性较弱。
[0008]该纳米抗体可应用到过表达间皮素的阳性肿瘤的诊断、治疗领域等。具体地，该纳米抗体可以以本申请下文所述的嵌合抗原受体形式使用；还可以用作抗体类治疗/检测药物，如单独使用或者包被在脂质体等递送系统中，也可以多价抗体、融合型纳米抗体(如与牛血清白蛋白、IgG
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Fc、阿霉素等结合形成新的融合分子)等形式使用。
[0009]第二方面，本申请提供了一种靶向间皮素的嵌合抗原受体(简写为“CAR
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meso”)，包括顺次连接的靶向间皮素的纳米抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区，其中，所述靶向间皮素的纳米抗体如本申请第一方面所述。
[0010]上述“顺次连接”可以理解为：所述靶向间皮素的纳米抗体的氨基酸序列的羧基端与所述胞外铰链区的氨基酸序列的氨基端相连，胞外铰链区的氨基酸序列的羧基端与所述跨膜区的氨基酸序列的氨基端相连，所述跨膜区的氨基酸序列的羧基端与所述胞内信号区
NO：6与SEQ ID NO：4相比，多了信号肽的苷酸序列。
[0018]其中，信号肽的编码基因可较好地指导嵌合抗原受体CAR
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meso表达到细胞表面，但在CAR
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meso表达到T细胞表面时，信号肽在蛋白翻译成熟过程中被信号肽酶切割。因此，在翻译成的CAR
‑
meso的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)中并未带有信号肽的氨基酸序列。
[0019]可选地，所述信号肽的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列。考虑到编码基因的碱基简并性质，所述信号肽的编码基因不限于包括如SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列。
[0020]本申请第二方面提供的靶向间皮素的嵌合抗原受体CAR
‑
meso可以专一性地靶向表达间皮素抗原的肿瘤细胞，在其与间皮素抗原结合后，可以使T细胞的胞内信号区被激活，促进T细胞在患者体内的扩增，并高效且特异性地杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞几乎不会造成损伤，从而实现较好的肿瘤治疗效果。
[0021]第三方面，本申请提供了一种靶向间皮素的嵌合抗原受体T细胞，其表面表达如第二方面所述的靶向间皮素的嵌合抗原受体CAR
‑
meso。
[0022]该靶向间皮素的嵌合抗原受体T细胞可以专一性地靶向表达间皮素的肿瘤细胞，在CAR
‑
meso与肿瘤上的meso结合后，该CAR
‑
T细胞的胞内信号区被激活，促进其在患者体内的扩增，长效持久地发挥高效且特异性杀伤肿瘤细胞的能力，而对正常细胞几乎不会造成损伤。
[0023]第四方面，本申请提供了一种重组载体，该重组载体包括如第二方面所述的靶向间皮素的嵌合抗原受体CAR
‑
meso的编码基因。
[0024]如上所述，该重组载体携带的编码基因包括从5
’
端到3
’
端顺次连接的信号肽的编码基因、靶向间皮素的纳米抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因、胞内信号区的编码基因。可选地，该重组载体携带有如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列。进一步可选地，该CAR
‑
meso的编码基因包括SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。
[0025]可选地，所述重组载体中的载体为病毒载体和非病毒载体中的至少一种。其中，非病毒载体包括质粒载体和噬菌体载体。具体地，所述质粒载体可以但不限于为真核质粒载体、原核质粒载体、微环DNA、转座子等。其中，所述病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。优选为慢病毒载体，例如pCDH质粒、pWPXLD载体、pLEX
‑
MCS载体、pSico载体和pCgpV载体中的至少一个，但不限于此。
[0026]本申请第四方面提供的重组载体安全高效，可以稳定高效地将CAR
‑
meso的编码基因导入宿主细胞中或复制，并可以用于制备靶向间皮素的嵌合抗原受体T细胞，使所述T细胞持续、稳定地发挥靶向、杀伤效力。
[0027]第五方面，本申请提供了一种靶向间皮素的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括：
[0028](1)提供靶向间皮素的嵌合抗原受体的编码基因，包括从5
’
端到3
’
端顺次连接的信号肽的编码基因、靶向间皮素的纳米抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因、胞内信号区的编码基因，其中，所述靶向间皮素的纳米抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列；
[0029](2)将所述靶向间皮素的嵌合抗原受体的编码基因插入到基因传递载体中，得到
重组基因传递载体；
[0030](3)将所述重组基因传递载体进行包装并转染宿主细胞，得到重组慢病毒；
[0031](本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向间皮素的纳米抗体，其特征在于，所述靶向间皮素的纳米抗体包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。2.如权利要求1所述的靶向间皮素的嵌合抗原受体，其特征在于，所述靶向间皮素的纳米抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。3.一种靶向间皮素的嵌合抗原受体，其特征在于，所述靶向间皮素的嵌合抗原受体包括顺次连接的靶向间皮素的纳米抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区，其中，所述靶向间皮素的纳米抗体如权利要求1或2所示。4.如权利要求3所述的靶向间皮素的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞外铰链区包括CD8α铰链区，所述跨膜区包括CD8跨膜区，所述胞内信号区包括从氨基端到羧基端顺次连接的4
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1BB信号区和CD3ζ信号区。5.如权利要求4所述的靶向间皮素的嵌合抗原受体，其特征在于，所述靶向间皮素的嵌合抗原受体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。6.如权利要求5所述的靶向间皮素的嵌合抗原受体，其特征在于，所述靶向间皮素的嵌合抗原受体的编码基因包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。7.一种靶向间皮素的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，其表面表达如权利要求3
‑
6任一项所述的靶向间皮素的嵌合抗原...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘茂玄，王琪，许晨光，戴昆，
申请(专利权)人：深圳宾德生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：