一种抗人源CD146的特异性单克隆抗体制造技术

本发明专利技术公开了一个抗人源CD146的特异性单克隆抗体，属于抗体研究技术领域。本发明专利技术通过构建人源CD146特异的Fab噬菌体展示文库，筛选出了一个抗人源CD146的特异性单克隆抗体，所述抗体的氨基酸序列为：轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：1；重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：2。该抗体能够在分子,肺癌细胞水平特异性识别人源CD146。性识别人源CD146。性识别人源CD146。

【技术实现步骤摘要】
一种抗人源CD146的特异性单克隆抗体


[0001]本专利技术属于抗体研究
，具体涉及一种抗人源CD146的特异性单克隆抗体。

技术介绍

[0002]噬菌体抗体库技术（phage antibody library）是近年发展的一项分子生物学新技术，近年来越来越多的学者利用这项技术获得目标抗体以应用于医疗制药及安全检测等多个领域。噬菌体抗体库技术的发展和应用，为抗体
带来了巨大的变化，极大地推动了各种性能优良基因工程抗体的开发和应用。获得大容量的抗体库是筛选获得特异性抗体的前提条件。
[0003]因单克隆抗体在癌症、感染性疾病和许多其它的人类疾病中具有诊断和治疗价值，最终选择可广泛应用于临床的单克隆抗体，基于CD146在早期肺癌中的诊断价值，筛选制备特异性CD146单克隆抗体，该抗体能够在分子, 肺癌细胞水平特异性识别人源CD146，为恶性肺结节的早期诊断及治疗提供研究基础。

技术实现思路

[0004]本专利技术通过构建人源CD146特异的Fab噬菌体展示文库，筛选出了一种抗人源CD146的特异性单克隆抗体，该抗体能够在分子，肺癌细胞水平特异性识别人源CD146。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种抗人源CD146的特异性单克隆抗体，所述抗体的氨基酸序列为：轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：1；重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：2。
[0006]进一步，所述抗体能够在分子, 肺癌细胞水平特异性识别人源CD146。
[0007]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术通过构建人源CD146特异的Fab噬菌体展示文库，筛选出了一种抗人源CD146的特异性单克隆抗体，亲和力高，能够在分子，肺癌细胞水平特异性识别人源CD146。
附图说明
[0008]图1为单克隆抗体MM01
‑
MM05的亲和力；图2为A549和H460细胞CD146的表达；图3为单克隆抗体MM01与H460和A549细胞表面CD146抗原的亲和力。
具体实施方式
[0009]下面结合附图和具体的实施例对本专利技术的技术方案及效果做进一步描述，但本专利技术的保护范围并不限于此。
[0010]实施例1一种抗人源CD146的特异性单克隆抗体，所述抗体的氨基酸序列为：
抗体轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：1，DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPWTFGQGTKVEIK；抗体重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：2，EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCEASGFTVGNSYMSWVRQAPGKGLEWVSLMYSGGSTNYAASVKGRFTISRDNSKNTLNLQMTSLRAEDTAVYYCVRVVYGSGIAWGQGTLVTVSS。
[0011]抗体Fab轻链氨基酸序列为SEQ ID NO：3，DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKLYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC；抗体Fab重链氨基酸序列为SEQ ID NO：4，EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCEASGFTVGNSYMSWVRQAPGKGLEWVSLMYSGGSTNYAASVKGRFTISRDNSKNTLNLQMTSLRAEDTAVYYCVRVVYGSGIAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT。
[0012]本专利技术抗人源CD146的特异性单克隆抗体的获取方法包括以下步骤：1）采用噬菌体库筛选CD146 Fab抗体单克隆抗体在癌症、感染性疾病和许多其它的人类疾病中具有诊断和治疗价值。我们基于噬菌体展示技术，从天然噬菌体库中筛选展示在噬菌体表面，高亲和力的特异性CD146 Fab抗体片段。CD146抗原购自百普赛斯生物科技股份有限公司，大肠杆菌TG1，购自英韦创津（Invitrogen)公司。
[0013]方法为：取1ml噬菌体库，孵以不同浓度的CD146抗原进行4轮淘选，第一轮筛选抗原浓度为10ug/ml,第二轮筛选抗原浓度为1ug/ml，第三轮筛选抗原浓度为1ug/ml，第四轮筛选抗原浓度为1ug/ml。从上述淘选结果中随机挑选克隆进行ELISA实验，根据OD405读数排序，以三个最低读数的平均值作为对照，判定OD405＞3倍对照的克隆为阳性克隆，依据OD405数值高低排序，送适量样品测序，分析序列多样性，记录独特抗体序列。
[0014]2）哺乳动物细胞表达系统制备载体片段的制备，哺乳动物细胞表达选用Flp
‑
In TM(Invitrogen, TM)系统。表达结构包括启动子（CMV）、带有PDGFR跨膜序列（TM）的人抗体全长基因，其可在哺乳动物细胞基因组的特定位点引入Flp重组靶点 (FRT)，通过Flp重组酶介导基因重组，将含有目的基因的表达载体整合进入基因组的单一FRT位点。载体中的选择性潮霉素基因不包括起始密码子和启动子，而宿主细胞基因组的FRT位点含有ATG密码子及上游的启动子。只有当载体在FRT位点精确整合使潮霉素基因与ATG密码子及上游的启动子形成正确的阅读框架，潮霉素基因才能够表达。在pcDNA5/FRT载体中，平行插入两个基因表达框，能同时表达重链和轻链，生成Flp载体。使用SfiI和Esp3I对载体进行酶切，并经1％琼脂糖凝胶电泳后回收目的片段备用，可分别得到3kb和5kb目的片段。
[0015]单克隆抗体轻链、重链片段的制备，以cDNA第一条链为模板，设计引物，分别用PCR扩增抗体轻链和重链可变区基因。PCR条件为：94℃预变性5min，然后进行35个循环的PCR扩增(94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min)，随后在延长温度下反应7min，以确保全长
目的片段的合成。用1％的琼脂糖凝胶电泳分离纯化目的片段。将回收得到的0.65kb轻链和0.35kb重链片段与3kb和5kb载体片段按照1:1:1:1的比例混合后连接、转化大肠杆菌，得到质粒DNA备用。
[0016]3）哺乳动物细胞表面展示单克隆抗体将抗体的重链和轻链的编码序列插入载体，生成的载体瞬时转染FCHO细胞进行抗体表达。转染48小时后，用荧光标记的特异性抗原和针对人的轻链抗体对细胞染色，用流式细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗人源CD146的特异性单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的氨基酸序列为：轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：1；重链可变区氨基酸序列为SEQ I...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓菊，崔凯，轩伟霞，魏楠，康谊，孙雅，
申请(专利权)人：河南省人民医院，
类型：发明
国别省市：