增强细小病毒载体递送的修饰衣壳蛋白制造技术

本发明专利技术涉及转导效率提高的修饰细小病毒衣壳蛋白、包括所述衣壳蛋白的病毒载体及利用所述衣壳蛋白递送核酸至细胞或受试者的方法。所述衣壳蛋白递送核酸至细胞或受试者的方法。所述衣壳蛋白递送核酸至细胞或受试者的方法。

【技术实现步骤摘要】
增强细小病毒载体递送的修饰衣壳蛋白
优先权声明
[0001]本申请要求2015年12月14日提交的序列号为62/266,941的美国临时申请的权益，通过引用，该临时申请全文纳入本申请中。联邦支持声明
[0002]本专利技术得到美国政府支持，是美国国立卫生研究院拨款项目AI080726、DK084033、HL112761、AI072176、AR064369和GM007050完成的专利技术。美国政府享有本专利技术的某些权利。


[0003]本专利技术涉及转导效率提高的修饰细小病毒衣壳蛋白、包括所述衣壳蛋白的病毒载体及利用所述衣壳蛋白递送核酸至细胞或受试者的方法。

技术介绍

[0004]目前，重组腺相关病毒(rAAV)的各种血清型被用于各种临床试验中(例如，rAAV1用于脂蛋白脂酶缺乏症、rAAV2用于莱伯先天性黑朦症，rAAV8用于血友病)。在这些血清型中，rAAV1被认为最适合肌内(i.m.)递送，不管是直接治疗肌肉疾病(例如，肌肉萎缩症)或从治疗性蛋白质分泌到血液中受益的病症(例如，α
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1抗胰蛋白酶(AAT)缺乏症)。这种方法的主要局限是即使施用高剂量的rAAV，转基因表达也一直低于治疗剂量。例如，虽然rAAV
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AAT临床试验结果表明，肌内注射后，血清中AAT浓度呈现剂量依赖性增加，但是，在高剂量队列中，仅实现～3％靶向AAT表达。由于该队列要求每次注射1.35mL，共肌内注射100次，因此，将剂量提高到疾病治疗必需水平可能并不可行。最近批准的rAAV1<br/>‑
类药物格利贝拉(Glybera)也报告了类似现象。要使rAAV基因增强治疗成为以上疾病的实用选择，必须改善其在肌肉组织内的转导效率。
[0005]提高转基因表达的工作分为内源法与/或外源法，在内源法中，rAAV衣壳和转基因本身被修饰从而增强转导，在外源法中，在施用rAAV的同时开展补充治疗。虽然外源法，如免疫抑制法改善了转导，但是，将rAAV生物学新发现整合到临床试验设计中的方法一直是最成功的策略。随着众多天然AAV血清型，及其偏好的组织转导模式的研究，这一点得到了很好地证明。这样可以使AAV血清型与靶器官正确配对(例如，肌内递送rAAV的临床试验表明，采用rAAV1显然比以前采用的rAAV2更成功)。此外，血清型比较生物学和结构分析促进了rAAV的定向演变和合理工程操作，开发了新一代翻译载体。
[0006]人们已经辨别了最常见rAAV血清型的衣壳结构。每个衣壳结构包括60个重复单体，所述单体由保守β
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桶状核心组成，周围散布构成衣壳表面拓扑的大环。通过将rAAV2与同源性最低血清型rAAV4的结构进行对比，定义了共9个可变区(VR；VRI至VRIX)。VR的氨基酸含量导致每个血清型的不同表型，例如，受体结合、抗原反应性及转导效率。将rAAV2的VR(原型rAAV)与更有效的肌肉转导子(如rAAV1)比较，使首个工程rAAV衣壳进入临床试验。rAAV2.5由rAAV1五个氨基酸接枝的rAAV2衣壳组成，隔离它们在肌肉内对rAAV1效率的作用。随访研究表明，要明显增强rAAV2在肌肉内的效率，只需改变单个氨基酸；即在264位置
后插入不同的氨基酸，从而创建新位置265。持续的临床前研究表明，rAAV2的翻译性受到血清型，如rAAV1和rAAV6的高效率，及群内rAAV2中和抗体高主导性限制。通过调节衣壳骨架上的表面氨基酸，这些“新一代”血清型的传导效率进一步得到提高。
[0007]随着rAAV1已经成为肌肉骨骼应用的首选，rAAV1在67％肌内临床试验中使用，过去5年中在86％肌内临床试验中使用，因此，改善rAAV1效率对临床转化来说正当其时。本专利技术提供具有改善特点的修饰衣壳蛋白，适合用于制备具有广泛用途，包括基因治疗的载体。

技术实现思路

[0008]本研究分析了rAAV衣壳结构，以制定设计用于改善肌肉转导的工程策略。与rAAV2265插入突变相反，从rAAV1衣壳删除位置265最高程度地提高了肌肉组织内的转基因递送和表达。此外，通过同源建模和突变分析，鉴定了衣壳共同作用别构性控制rAAV6和rAAV2转导效率的两个区。该结果提供了因破坏氢键结合模式而使VR1环区域失稳的机理。该发现允许对这些血清型合理突变，从而使转导效率提高至少一个数量级。此外，嵌合体rAAV血清型内的临床AAT转基因表达比亲代rAAV1提高达12.5倍，支持这些构建体在临床试验中应用。该研究证明了采用rAAV衣壳结构建模和分子剖析的合理设计方法，用于改善更适合翻译研究的递送制剂。
[0009]本专利技术的一个方面涉及一种细小病毒衣壳蛋白，包含来自AAV血清型或T＝1二十面体衣壳结构的任何其它细小病毒的衣壳蛋白氨基酸序列，其中可变区1(VR1)的环包括AAV1衣壳蛋白氨基酸残基258至272或另一个AAV或细小病毒衣壳蛋白的相应氨基酸残基，所述可变区1的环通过删除与/或替换一个或多个氨基酸残基进行修饰，由于所述残基编排的氢键模式被靶向破坏，导致环内区域失稳，其中与包含未修饰衣壳蛋白的病毒载体相比，所述修饰衣壳蛋白使包括所述衣壳蛋白的病毒载体的转导效率得到提高。
[0010]本专利技术的另一个方面涉及本专利技术所述衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白包括与硫酸肝素结合的AAV血清型或其它细小病毒的氨基酸序列，其中调节衣壳蛋白与硫酸肝素结合的一个或多个氨基酸残基被替换与/或删除，其中所述衣壳蛋白与硫酸肝素的结合大幅减少。
[0011]本专利技术的另一个方面涉及一种AAV衣壳蛋白，包括来自AAV3a、AAV3b、AAV6或AAV8血清型的氨基酸序列，其中调节衣壳蛋白与硫酸肝素结合的一个或多个氨基酸残基被替换与/或删除，其中所述衣壳蛋白与硫酸肝素的结合大幅减少。
[0012]本专利技术的另一个方面涉及一种AAV衣壳蛋白，包括来自AAV2、AAV3a或AAV3b血清型的氨基酸序列，其中所述衣壳蛋白在紧接AAV2衣壳蛋白残基264后面或在紧接AAV3a或AAV 3b衣壳蛋白相应残基后面插入一个或多个氨基酸残基，且调节衣壳蛋白与硫酸肝素结合的一个或多个氨基酸残基被替换与/或删除，其中所述衣壳蛋白与硫酸肝素的结合大幅减少；其中与包含未修饰衣壳蛋白的病毒载体相比，所述修饰衣壳蛋白使包括所述衣壳蛋白的病毒载体的转导效率得到提高。
[0013]本专利技术的另一个方面涉及一种编码本专利技术所述衣壳蛋白的多核苷酸、包括本专利技术所述衣壳蛋白的细小病毒衣壳、包括本专利技术所述衣壳蛋白的病毒载体及包括本专利技术所述病毒载体的药物组合物。
[0014]本专利技术的另一个方面涉及一种将核酸递送给细胞的方法，所述方法包括在足以使核酸进入到细胞内的条件下将所述细胞与本专利技术病毒载体或药物组合物接触。
[0015]本专利技术的另一个方面涉及一种将核酸递送到受试者体内的方法，所述方法包括向受试者施用本专利技术所述的病毒载体或药物组合物。
[0016]本专利技术的另一个方面涉及一种将核酸递送给受试者的方法，所述方法包括向受试者施用已经在足以使核酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细小病毒衣壳蛋白，包括来自腺相关病毒(AAV)血清型或T＝1二十面体衣壳结构的任何其它细小病毒的衣壳蛋白氨基酸序列，其中可变区1(VR1)的环包括AAV1衣壳蛋白氨基酸残基258至272或另一个AAV或细小病毒衣壳蛋白的相应氨基酸残基，所述可变区1的环通过删除与/或替换一个或多个氨基酸残基进行修饰，由于所述残基编排的氢键模式被靶向破坏，导致环内区域失稳，其中与包含未修饰衣壳蛋白的病毒载体相比，所述修饰衣壳蛋白使包括所述衣壳蛋白的病毒载体的转导效率与/或修饰组织特异性得到提高。2.根据权利要求1所述的衣壳蛋白，其中AAV1衣壳蛋白氨基酸残基258至272中的一个或多个氨基酸残基或另一个AAV或细小病毒衣壳蛋白的相应氨基酸残基被删除。3.根据权利要求1所述的衣壳蛋白，其中AAV1衣壳蛋白氨基酸残基261至269中的一个或多个氨基酸残基或另一个AAV或细小病毒衣壳蛋白的相应氨基酸残基被删除。4.根据权利要求1所述的衣壳蛋白，其中AAV1衣壳蛋白的氨基酸残基265或另一个AAV或细小病毒衣壳蛋白的相应氨基酸残基被删除。5.根据权利要求1所述的衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白包括与硫酸肝素结合的AAV血清型或其它细小病毒的氨基酸序列，其中调节衣壳蛋白与硫酸肝素结合的一个或多个氨基酸残基被替换与/或删除，其中所述衣壳蛋白与硫酸肝素的结合大幅减少。6.根据权利要求5所述的衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白包括来自AAV3a、AAV3b、AAV6或AAV8血清型的氨基酸序列。7.根据权利要求5所述的衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白包括来自AAV6血清型的氨基酸序列，其中所述氨基酸残基531被替换，从而大幅减少与硫酸肝素的结合。8.根据权利要求7所述的衣壳蛋白，其中所述氨基酸残基531被谷氨酸替换。9.一种腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，包括来自AAV3a、AAV3b、AAV6或AAV8血清型的氨基酸序列，其中调节衣壳蛋白与硫酸肝素结合的一个或多个氨基酸残基被替换与/或删除，其中所述衣壳蛋白与硫酸肝素的结合大幅减少。10.根据权利要求9所述的衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白包括来自AAV6血清型的氨基酸序列，其中所述氨基酸残基531被替换，从而大幅减少与硫酸肝素的结合。11.根据权利要求10所述的衣壳蛋白，其中所述氨基酸残基531被谷氨酸替换。12.根据权利要求1
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11任一项所述的衣壳蛋白，其中与包含未修饰衣壳蛋白的病毒载体相比，所述衣壳蛋白的肌肉转导提高了至少大约10％。13.根据权利要求1
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12任一项所述的衣壳蛋白，其中与包含未修饰衣壳蛋白的病毒载体相比，所述衣壳蛋白的肝脏转导提高了至少大约10％。14.根据权利要求1
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13任一项所述的衣壳蛋白，其中至少一个酪氨酸残基被替换，从而改善了心肌转导效率。15.根据权利要求14所述的衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白包括来自AAV1或AAV6血清型的氨基酸序列，酪氨酸替换是Y445F。16.编码权利要求1
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15任一项所述衣壳蛋白的多核苷酸。17.包含权利要求1
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15任一项所述衣壳蛋白的细小病毒衣壳。18.一种病毒载体，包括：(a)权利要求17所述的细小病毒衣壳；及(b)包含重组病毒模板的核酸，
其中所述核酸被所述细小病毒衣壳包裹。19.根据权利要求18所述的病毒载体，其是一种AAV载体。20.根据权利要求18或19所述的病毒载体，其中所述病毒载体对骨骼肌、心肌与/或膈肌表现出系统嗜性。21.根据权利要求20所述的病毒载体，其中所述病毒载体对骨骼肌表现出系统嗜性。22.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：R，
申请(专利权)人：北卡罗来纳大学教堂山分校，
类型：发明
国别省市：